摘要
Dmrt5 是 Dmrt 基因家族的重要一员，是与动物性别决定、性腺发育、器官功能维持等密切相关的转录因子。为探讨缢蛏(Sinonovacula constricta) Dmrt5 基因(ScDmrt5)在性腺发育中的作用，本研究克隆、鉴定了 2 个 ScDmrt5 基因，并研究了其在性腺不同发育时期的表达特征。ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 分别编码 389、374 个氨基酸，均具备 DM 结构域(Dmrt homology domain)和 DMA 结构域(Dmrt-associated domain)；在性成熟期，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 在鳃、外套膜等组织中均有表达，并在精巢中的表达量显著高于卵巢(P<0.05)；在性腺不同发育时期，随着精巢不断发育成熟， ScDmrt5-1 基因的表达量逐步升高，在成熟期表达量最高(P<0.05)，而在卵巢中的表达趋势与之相反；ScDmrt5-2 基因表达量也随着精巢的不断发育成熟而逐步升高，而在卵巢各个发育时期的表达量均较低且无显著差异。ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 蛋白均主要定位在精巢的精原细胞、精母细胞、精细胞和精子及卵巢的卵原细胞、卵母细胞和成熟卵细胞中。综上表明，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 可能主要参与缢蛏精巢的发育及功能维持，并可能在呼吸和神经感知等方面发挥重要作用。
Abstract
The razor clam, Sinonovacula constricta, has become a major economic mollusk in coastal East Asia because of its short culture cycle, rapid growth, and high yield, which have profoundly impacted the growth and development of mollusks in the aquaculture industry. However, compared with other mollusks, razor clam reproduction presents several challenges such as asynchronous spawning, poorly regulated reproduction, and a high rate of embryonic deformities, which greatly affect artificial breeding and the development of new varieties. Therefore, it is important to study the mechanisms underlying gonadal development. Gonadal development is the basis of animal breeding and reproductive control, and its mechanisms vary across different species. Therefore, a deeper understanding of gonadal development can provide a theoretical basis for genetic breeding and gender control. Gonadal development is affected by external factors (e.g., temperature and food) and endogenous gender-related genes. The Dmrt (double-sex and mab-3 related transcription factor) gene family is a class of transcription factors involved in sex determination and gonadal development in animals, with all encoded proteins containing highly conserved zinc-finger DM domains. Dmrt5 is an important member of this family, and its encoded protein is somewhat different from that of other family members because it includes conserved DM and DMA domains. It plays important roles in sex determination, gonadal development, and organ function maintenance in animals. In this study, two Dmrt5 genes were identified through whole-genome and gonadal transcriptome analyses of razor clams. To investigate the roles of Dmrt5 genes (ScDmrt5) in gonadal development of S. constricta, the full-length cDNA sequences of the two ScDmrt5 genes were cloned using the rapid amplification of cDNA ends (RACE) technique. The proteins encoded by the ScDmrt5 genes were analyzed for sequence comparison, conserved structural domains, and phylogenetic relationships using various bioinformatics tools. The expression patterns of ScDmrt5 genes/proteins in different tissues and gonadal development stages were investigated by qRT-PCR and immunofluorescence techniques. The open reading frame (ORF) sequence of ScDmrt5-1 was 1,170 bp, encoding 389 amino acids, and that of ScDmrt5-2 was 1,125 bp, encoding 374 amino acids. Both possessed conserved DM and DMA structural domains. The phylogenetic analysis showed that ScDmrt5-1 and ScDmrt5-2 first converged into a small clade with molluscan Dmrt5 proteins. Their motif locations, types, and quantity were similar, and their amino acid identities with other molluscan Dmrt5 proteins exceeded 50%, suggesting that the two Dmrt5 proteins of S. constricta were highly similar to Dmrt5 in other mollusks. ScDmrt5-1 and ScDmrt5-2 were localized on the same chromosome (chr12), but their positions were far apart without tandem duplication. Based on sequence comparisons, conserved domains, phylogenetic analysis, and chromosome localization, the two Dmrt5 genes were designated ScDmrt5-1 and ScDmrt5-2. The qRT-PCR analysis revealed that ScDmrt5-1 and ScDmrt5-2 were expressed in seven tissues (gill, mantle, testis, ovary, siphon, hepatopancreas, and foot), with significantly higher expression levels in the gills than in other tissues (P<0.05). In the mature stage of the gonads, ScDmrt5-1 and ScDmrt5-2 expression levels were significantly higher in the testes than in the ovaries (P<0.05). Based on the morphological characteristics of gonad cells of razor clams using paraffin sections and HE staining, the gonadal development process of the testis and ovary was categorized into four stages: proliferative, growing, mature, and spawning. During these stages, the expression level of ScDmrt5-1 gradually increased with testis development, peaking at the mature stage (P<0.05). In contrast, its expression exhibited an opposite trend in the ovary. ScDmrt5-2 expression also gradually increased with testis development, reaching higher levels in the mature and spawning stages, where it was significantly higher than in the ovary at the same stage (P<0.05). However, ScDmrt5-2 expression in the ovary remained relatively low and did not differ significantly between developmental stages. The immunofluorescence analysis revealed that ScDmrt5-1 and ScDmrt5-2 proteins were mainly located in the germ cells of female and male gonads, including oocytes and mature oocytes in the ovaries, and spermatogonia, spermatocytes, and mature sperm in the testis. In conclusion, ScDmrt5-1 and ScDmrt5-2 may be primarily involved in testis development and functional maintenance with potential roles in respiration and neuroperception. This study elucidates the expression characteristics of Dmrt5 in razor clam gonadal development. It also preliminarily explores the role of Dmrt5 in the gonadal development of razor clams, which could provide theoretical guidance for reproductive regulation, artificial breeding, and the development of new S. constricta varieties.
Keywords
性腺发育是动物繁育和生殖调控技术研究的基础，对性腺发育基因的研究不仅可以解析性别决定及性腺发育的分子机制，而且可为生殖调控、遗传育种等提供理论依据和技术支撑。不同动物的性腺发育机制各不相同，具有较高的复杂性与多样性（桑润滋，2002）。影响性腺发育的因素，既有来自内部染色体和性别相关基因的调控，又有外界条件等一系列因素的影响（Yamaguchi et al，2006）。其中，贝类性腺发育机制较为复杂，绝大多数为雌雄异体，如栉孔扇贝（Azumapecten farreri）、泥蚶（Tegillarca granosa）等，少数种为雌雄同体，如海湾扇贝（Argopecten irradians）等，还有一些种类性别易受环境变化的影响，表现为环境敏感性，会出现雌雄转换或雌雄同体现象。如太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）和马氏珠母贝（Pinctada fucata）等（Collin et al，2013）。一般而言，贝类的性腺发育不仅受到外界环境因素的影响（Yan et al，2010; 於锋等，2016），而且还受到内源性激素和相关基因等的调控。目前，关于贝类性腺发育基因的研究主要集中在性别决定和分化上，已鉴定到 Dmrt、Fox12、Sox9、Fem-1、Dax1 等基因（周丽青等，2020; 于红等，2023）。
Dmrt 是一类与线虫 Mab-3、果蝇 Dsx 基因同源的转录因子，是动物性别决定和性腺发育的研究热点。除哺乳动物 Dmrt8 基因外，所有 Dmrt 家族成员编码的蛋白均包含高度保守的锌指双性别同源结构域（Dmrt homology domain，DM）（Zarkower，2001; 张月圆等，2013; 于红等，2023）。目前，已在多种动物中鉴定出 Dmrt 基因，然而成员种类和数目因物种而异，如哺乳动物中有 8 种 Dmrt 基因家族成员（Dmrt1~8），鸟类中有 4 种（Dmrt1~4）、爬行类有 6 种（Dmrt1~6）、两栖类和鱼类有 5 种（Dmrt1~5）（李法君等，2016）。自第一个 Dmrt 基因在哺乳动物中发现以来，Dmrt 基因家族被认为是一类重要的动物性别决定和性腺发育的转录因子。例如，Dmrt1 基因是参与高等动物性别决定、分化的关键基因，是雄性性腺发育所必需的（Kim et al，2007）。Dmrt5 是 Dmrt 家族的重要一员，其编码蛋白与其他成员有所不同，除具有一个保守的 DM 结构域外，还有一个 DMA 结构域（Dmrt-associated domain）（Zarkower，2001）。研究表明，Dmrt5 基因的组织表达具有广泛性，不仅在性腺发育中具有重要作用，还参与神经发育、免疫等生命过程。在哺乳动物中，Dmrt5 仅在人（Homo sapiens）精巢中表达，而在小鼠（Mus musculus）的脑、精巢、卵巢、肾、肺等组织中均有表达，且在脑中表达量较高（Kim et al，2003）；在成体斑马鱼（Danio rerio）中，Dmrt5 基因仅在两性生殖细胞中表达，而在胚胎期的中脑和中后脑交接区也表达，主要参与下丘脑–垂体–性腺轴的形成（Guo et al，2004）；Dmrt5 基因在红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）性腺中不表达，但在雌雄个体的脾脏中表达，表明该基因可能参与免疫系统的形成（Yamaguchi et al，2006）；黄鳝（Monopterus albus）Dmrt5 在生殖细胞发育过程中均有表达，可能参与性别分化（Sheng et al，2014）；金钱鱼（Scatophagus argus）Dmrt5 可能参与雄性生殖细胞的分化和功能维持（古皓天等，2019）。在贝类中，Dmrt5 在太平洋牡蛎（张娜等，2015）、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）（葛静远，2020）、华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis）（Shi et al，2014）的雌、雄性腺中均有表达，推测其可能参与性别分化；马氏珠母贝 Dmrt5 基因在精巢、卵巢、鳃、外套膜、闭壳肌等组织中均有表达，其中在精巢中的表达量最高，可能主要参与精巢的发育和功能维持（于非非等，2009）。由此可见， Dmrt5 基因的表达模式因物种而异，其功能多样，可参与动物的性腺发育、神经、免疫等多个生命过程。
缢蛏（Sinonovacula constricta）由于养殖周期短、产量高、肉质鲜美等优点，已成为沿海地区主要的经济贝类之一。然而，相较于其他贝类，缢蛏繁殖存在产卵不同步、繁殖可调控性差、胚胎发育畸形率高等问题，给人工育苗和良种培育带来很大不便。因此，开展缢蛏性腺发育机制研究对苗种繁育、新品种培育格外重要。目前，关于缢蛏性腺发育的研究，国内外已有相关报道。Yan 等（2010）发现水温和叶绿素 a 含量会影响缢蛏的性腺发育。Xue 等（2021）认为积温是影响缢蛏性腺发育的关键环境因素。李琳等（2023）认为性类固醇激素合成酶基因 17β-HSD10、17β-HSD12、 17βHSD14 可能通过调控性类固醇激素合成/代谢影响性腺发育。然而，关于缢蛏 Dmrt5 基因在性腺发育中的作用研究还未见报道。基于此，本研究综合运用多种生物信息学软件对缢蛏 2 个 Dmrt5 基因进行鉴定，研究其在性腺发育中的表达特征，初步探讨 Dmrt5 基因在缢蛏性腺发育中的作用，以期为缢蛏繁殖调控、苗种繁育及新品种培育提供理论指导
1 材料与方法
1.1 实验材料
2022 年 4 月―2023 年 3 月于宁波市海洋与渔业科技创新基地沿海池塘定时采集缢蛏成贝，15 d 取样一次，每次随机选取生长状况良好、大小适中的个体 30~40 个，活体解剖取性腺组织，部分组织置于 4% 多聚甲醛中固定 24 h，再经过 50%乙醇脱水处理 1 h 后置于 70%乙醇 4℃长期保存，用于组织切片；部分组织置于液氮中速冻，–80℃冰箱保存，用于 RNA 提取。
在缢蛏性成熟期（2022 年 10 月），活体解剖取少量性腺组织置于显微镜下观察鉴别雌雄（若为游动精子即为雄性，若为圆形或椭圆形卵细胞即为雌性）。分别取雌、雄缢蛏各 4 个，活体解剖取精巢和卵巢组织（n=4），再分别取雌、雄缢蛏各 2 个的肝胰腺、斧足、鳃、外套膜和水管组织（n=4），液氮速冻，用于组织表达分析。
1.2 缢蛏 2 个 Dmrt5 基因的鉴定
基于缢蛏雌 / 雄性腺转录组（SRR9937008-SRR9937010，SRR9937011-SRR9937013）和基因组（WSYO00000000.1）信息，初步检测到 2 个 Dmrt5 基因的EST片段。根据SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）说明书要求设计特异性引物，将高质量 RNA 进行反转录和 cDNA 末端快速扩增，将扩增产物进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳、割胶回收、纯化和连接、转化到大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 感受态中，培养过夜。挑取单菌落置于加氨苄西林的 SOB 培养基中扩大培养，在 37℃恒温摇床中培养 3 h。采用菌液 PCR 方法检测阳性克隆，挑取阳性克隆子，送北京擎科生物科技有限公司测序。实验所用引物均由上海生工合成（表1）。
1.3 缢蛏 2 个 Dmrt5 基因及编码蛋白生物信息学分析
使用 DNA Star 软件进行序列拼接和开放阅读框预测；利用 SignalIP-5.0 在线软件（https://services. healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）预测蛋白信号肽序列，用 ExPASy（https://www.expasy.org/）预测蛋白理化性质；使用 TMHMM 2.0 在线软件（https:// services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）查找蛋白跨膜结构；利用 SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测蛋白二级结构；使用 DNAMAN 软件进行氨基酸多重序列比对；利用 MEME（https://meme-suite.org/meme/ tools/meme）预测蛋白保守基序 motif，用 NCBI CD-search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测保守结构域，并用 TBtools 进行可视化；利用 MEGA 11 软件的最大似然法构建系统进化树；基于缢蛏全基因组序列信息，在 gff3 文件中找到 2 个 Dmrt5 基因的染色体位置，并用 TBtools 软件绘制染色体定位图（Chen et al，2020）。
表1实验所用引物序列信息
Tab.1Sequence information of primers used in the experiment
1.4 缢蛏 2 个 Dmrt5 基因的时空表达特征分析
将保存于 70%乙醇中的缢蛏性腺组织进行石蜡切片、HE 染色，用显微镜（Nikon 80i，日本）观察精巢、卵巢的生殖细胞形态特征，鉴定性腺发育时期（增殖期、生长期、成熟期和排放期）。
利用 Trizol 法提取缢蛏不同组织、不同发育时期性腺组织的总 RNA，选取高质量、完整的 RNA 反转录获得 cDNA 第一链。利用 Primer 5.0 软件设计 2 个 Dmrt5 基因的荧光定量引物，以 18S rRNA（表1）为内参基因进行 qRT-PCR 扩增，反应体系为：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞，货号： Q711-02）10.0 μL，cDNA 第一链 8.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，PCR 扩增程序：95℃预变性 20 s，40 个循环：95℃变性 3 s，60℃退火 15 s，72℃延伸 10 s。采用 2–ΔΔCt 计算基因的相对表达水平，并用 SPSS 24.0 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和 T 检验，P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著。
1.5 缢蛏 2 个 Dmrt5 蛋白的细胞定位
基于缢蛏 2 个 Dmrt5 蛋白的氨基酸序列，送往杭州华安生物公司进行抗原制备，免疫新西兰大白兔，最终选择免疫效价高的兔子血清进行纯化，分别获得 ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 蛋白抗体，用于蛋白表达分析。
Western Blotting 法检测蛋白一抗特异性：用 RIPA 高效裂解液提取精巢、卵巢组织的总蛋白，用 BCA 试剂盒（赛默飞）检测蛋白浓度，取等量蛋白进行 SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、5% BSA 封闭，再分别用封闭液/Dmrt5 蛋白一抗（1∶500 稀释，杭州华安制备）孵育过夜（4℃），然后再用 HRP 标记的驴抗兔二抗（1∶200 稀释，杭州华安）孵育 1 h，最后经 ECL 显影、凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）拍照观察。
免疫荧光染色：将缢蛏精巢、卵巢各个发育时期的石蜡切片进行脱蜡、复水、抗原修复、5% BSA 室温封闭 1 h 后，再用蛋白一抗（1∶500 稀释）孵育过夜（4℃），然后在暗室环境滴加 FITC 标记的驴抗兔二抗（1∶200 稀释，杭州华安）室温孵育 1.5 h，最后加 DAPI 染色液（Beyotime，上海）避光染色 5 min，盖上盖玻片后进行荧光显微观察。
2 结果
2.1 缢蛏 2 个 Dmrt5 基因及编码蛋白的结构域及保守基序分析
缢蛏 Dmrt5-1 基因（ScDmrt5-1）（GenBank 登录号： QYC92817.1）的 ORF 序列长度为 1 170 bp，编码 389 个氨基酸，蛋白分子量为 42.607 kDa，等电点（pI）为 8.75；缢蛏 Dmrt5-2（ScDmrt5-2）（GenBank 登录号： PP971146）基因的 ORF 序列长度为 1 125 bp，编码 374 个氨基酸，蛋白分子量为 41.285 kDa，等电点（pI）为 9.28。两个蛋白都属于亲水性蛋白，不存在信号肽和跨膜区。二级结构预测结果显示，ScDmrt5-1 蛋白由 72 个α 螺旋、29 个 β 折叠和 288 个无规则卷曲组成，而 ScDmrt5-2 蛋白由 93 个α螺旋、28 个 β 折叠和 253 个无规则卷曲组成。
选取 23 个物种的 Dmrt4 或 Dmrt5 蛋白进行保守基序分析，共鉴定出 8 个保守基序（motif）。其中，贝类和脊椎动物的 motif 数量和位置分化十分明显（图1A、1B）。在脊椎动物中，Dmrt4 和 Dmrt5 蛋白均鉴定出 6 个 motif，分别是 motif1、motif2、motif3、 motif4、motif5 和 motif6；在贝类中，Dmrt4 和 Dmrt5 的 motif 分化不明显，难以区分，共鉴定出 motif1、 motif2、motif3、motif5、motif6、motif7 和 motif8 等 7 个 motif。与脊椎动物相比，贝类多了 motif7 和 motif8，缺少 motif4。ScDmrt5-1 与其他贝类 Dmrt5 的 motif 数量相同、位置相近，而 ScDmrt5-2 只有 motif1、motif2、 motif3、motif5、motif6 和 motif7，仅与硬壳蛤（Mercenaria mercenaria，XP_045159713.2）、菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum，XP_060600746.1）Dmrt5 的 motif 数量相同，位置相近（图1B）。
缢蛏 2 个 Dmrt5 蛋白均具有 Dmrt 基因家族蛋白的典型结构域，其中，ScDmrt5-1 具有 DM（34~80 aa）和 CUE_DMA（228~266 aa）结构域，而 ScDmrt5-2 蛋白具有 DM（48~94 aa）和 UBA_like_SF superfamily（215~252 aa）结构域（图1C）。
图1不同物种 Dmrt4 和 Dmrt5 的系统进化（Bootstrap 值=1 000）（A）、保守基序（B）及结构域（C）分析
Fig.1Phylogenetic (Bootstrap value = 1 000) (A) , conserved motifs (B) and structural domains (C) analysis of Dmrt4 and Dmrt5 from different species
2.2 缢蛏 2 个 Dmrt5 基因的染色体定位、蛋白同源性和系统演化分析
缢蛏 2 个 Dmrt5 基因均定位在同一条染色体上（chr12），位置分别为 chr12:53912504:53916665 和 chr12:14415730:14417754（图2），但二者距离较远，并且不存在串联重复。
图2缢蛏 2 个 Dmrt5 基因的染色体定位
Fig.2Chromosomal localizations of two Dmrt5 genes in S. constricta
氨基酸序列比对结果表明，ScDmrt5-1 蛋白与其他物种的氨基酸一致性在 32.88%~68.23%之间，相似性在 26.56%~43.68%之间；ScDmrt5-2 蛋白与其他物种的氨基酸一致性在 31.36%~51.11%之间，相似性在 35.56%~45.82%之间（表2）。其中，ScDmrt5-1 蛋白与厚壳贻贝（Mytilus coruscus）、紫贻贝（Mytilus edulis）、硬壳蛤（XP_045157593.1）、虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）、斑马贻贝（Dreissena polymorpha）、菲律宾蛤仔（XP_060578674.1）Dmrt5 的一致性均高于 50%； ScDmrt5-2 蛋白与硬壳蛤（XP_045159713.2）、菲律宾蛤仔（XP_060600746.1）Dmrt5 的一致性均在 50%以上，相似性在 35%左右。
系统进化树结果显示，贝类和脊椎动物 Dmrt4、 Dmrt5 蛋白分化明显。其中，贝类 Dmrt 蛋白首先分化成两支，然后再聚为一大支，最后与脊椎动物聚在一起。贝类之间 Dmrt4、Dmrt5 和 Dmrt4-5 蛋白分化不明显，共同聚为一支。 ScDmrt5-1 与硬壳蛤（XP_045157593.1）、三角帆蚌、菲律宾蛤仔（XP_ 060578674.1）、斑马贻贝首先聚为一支，再与其他贝类的 Dmrt4、Dmrt4-5、Dmrt5 聚为一大支；ScDmrt5-2 单独与菲律宾蛤仔（XP_060600746.1）、硬壳蛤（XP_045159713.2）聚为一支，符合自然进化规律，表现出高度的保守性和较近的亲缘关系。综合 motif、保守结构域、系统进化和染色体定位分析结果，表明缢蛏 2 个 Dmrt5 蛋白均与贝类 Dmrt5 具有很高的相似性。虽然它们定位在同一染色体上但距离较远，故分别命名为 ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2。
2.3 ScDmrt5-1和 ScDmrt5-2基因在不同组织及性腺发育中的表达分析
组织表达结果显示，ScDmrt5-1、ScDmrt5-2 在缢蛏 7 个组织中均有表达，且均在鳃中的表达量最高，显著高于其他组织（P<0.05）（图3）。在缢蛏性成熟期， 2 个 Dmrt5 基因在精巢中的表达量均显著高于卵巢（P<0.05）。
基于缢蛏精巢、卵巢组织的生殖细胞形态特征（李琳等，2023），将性腺发育时期分为 4 个时期。增殖期（5~6 月）：精巢的滤泡壁上形成多层精原细胞，数量增加的同时伴随精母细胞的产生（图4A-M1）；卵巢的滤泡壁上出现不连续分布的卵母细胞（图4A-F1）。生长期（7~8 月）：滤泡数量增加，体积增大，精巢中可见初级、次级精母细胞，并有少量精子（图4A-M2）； 卵巢中布满卵母细胞，并有少量成熟卵子（图4A-F2）。成熟期（9~10 月）：精巢中出现大量密集、呈辐射状排列的成熟精子（图4A-M3）；卵巢中成熟卵子相互挤压成多边形（图4A-F3）。排放期（11~12 月）：开始出现大小不一的空腔，随着配子的大量排放，精巢滤泡萎缩，残留少量精母细胞和精子（图4A-M4）；卵巢残留少量卵母细胞和成熟卵子（图4A-F4）。qRT-PCR 结果表明， ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 基因在雌、雄性腺各个发育时期均有表达。其中，ScDmrt5-1 在精巢发育过程中的表达量呈先升高后降低的趋势，即在成熟期表达量最高且显著高于其他时期（P<0.05），在增殖期的表达量最低（图4B）；而其在卵巢中的表达趋势与之相反，即在生长期和成熟期的表达量较低，显著低于增殖期和排放期（P<0.05）（图4B）。
ScDmrt5-2 基因在精巢的增殖期和生长期的表达量无显著差异，在成熟期的表达量显著升高（P<0.05），并且在排放期维持较高的表达水平；ScDmrt5-2 基因在卵巢不同发育时期的表达量均较低且无明显差异（图4C）；值得注意的是，ScDmrt5-2 在精巢各个发育时期的表达量均显著高于同时期卵巢（P<0.05）（图4C）。
2.4 ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 蛋白在性腺不同发育时期的亚细胞定位
Western Blotting 结果显示，在不加 ScDmrt5-1 或 ScDmrt5-2 蛋白一抗时，精巢和卵巢组织的 42.607 kDa 或 41.285 kDa 目标条带处均未见蛋白条带，说明未产生非特异性结合（图5）；加入蛋白一抗后，在 42.607 kDa（ScDmrt5-1）、41.285 kDa（ScDmrt5-2）处，各见一条单一的目的蛋白条带（图5），表明 2 个 Dmrt5 蛋白一抗特异性较好，可用于后续细胞定位分析。
表2缢蛏 2 个 Dmrt5 蛋白与其他物种的一致性和相似性比较
Tab.2Identity and similarity analysis of two Dmrt5 proteins between S. constricta and other species
图3ScDmrt5-1（A）和 ScDmrt5-2（B）基因的组织表达分析（n=4）
Fig.3Tissue expression analysis of ScDmrt5-1 (A) and ScDmrt5-2 (B) genes in S. constricta (n=4)
1：鳃；2：外套膜；3：精巢；4：卵巢；5：水管；6：肝胰腺；7：斧足。不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。
1 : Gill; 2: Mantle; 3: Testis; 4: Ovary; 5: Siphon; 6: Hepatopancreas; 7: Foot. Different lower case letters represent significant differences (P<0.05) .
图4缢蛏性腺不同发育时期生殖细胞形态学观察（A）及 ScDmrt5-1（B）和 ScDmrt5-2（C）基因在不同发育时期的性腺中的表达（n=6）
Fig.4Histological observation of gonads at the various development stages (A) and expression of ScDmrt5-1 (B) and ScDmrt5-2 (C) genes at different gonadal development periods in S. constricta (n=6)
A 图中：M1 为精巢增殖期，F1 为卵巢增殖期；M2 为精巢生长期，F2 为卵巢生长期；M3 为精巢成熟期，F3 为卵巢成熟期；M4 为精巢排放期，F4 为卵巢排放期。Fc：滤泡细胞；Sg：精原细胞；Sc：精母细胞；St：精细胞；Sz：精子； Og：卵原细胞；Oc：卵母细胞；Mo：成熟卵细胞。标尺：50 μm。 B 和 C 图中：1 为增殖期，2 为生长期，3 为成熟期，4 为排放期。不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。
In Fig A, M: Testis, F: Ovary; M1 and F1: Proliferative stage; M2 and F2: Growing stage; M3 and F3: Mature stage; M4 and F4: Spawning stage. Fc: Follicular cell; Sg: Spermatogonium; Sc: Spermatocyte; St: Spermatid; Sz: Spermatozoon; Og: Oogonium; Oc: Oocyte; Mo: Mature oocyte. Scale bar: 50μm. In Fig.B and C, 1: Proliferative stage; 2: Growing stage; 3: Mature stage; 4: Spawning stage. Different lower case letters represent significant differences (P<0.05) .
细胞定位结果表明，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 蛋白在精巢、卵巢不同发育时期（增殖期、生长期、成熟期和排放期）的生殖细胞中均有表达，主要定位在各期生殖细胞的细胞质中，且阳性信号显著比周围结缔组织强（图6和图7）。其中，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 蛋白主要定位在卵巢的卵原细胞、卵母细胞和成熟卵细胞及精巢的精原细胞、精母细胞、精细胞的细胞质中（图6和图7）。
图5ScDmrt5-1（A）和 ScDmrt5-2（B）蛋白抗体的特异性检测
Fig.5Specific detection of antibodies against ScDmrt5-1 (A) and ScDmrt5-2 (B) proteins
♂1~♂3 和♀1~♀3：加 ScDmrt5-1/ScDmrt5-2 蛋白一抗；♂1′~♂3′和♀1′~♀3′：未加一抗，为空白对照。
♂1~♂3 and ♀1~♀3: Addition of protein primary antibody of ScDmrt5-1/ScDmrt5-2; ♂1′~♂3′ and ♀1′~♀3′: Blank control without primary antibody.
图6ScDmrt5-1 蛋白在缢蛏精巢、卵巢不同发育时期的表达分析
Fig.6Expression analysis of ScDmrt5-1 protein in different developmental stages of testis and ovary from S. constricta
FITC：绿色荧光信号，DAPI：蓝色荧光信号；Sg：精原细胞；Sc：精母细胞；Sz：精子；Og：卵原细胞； Oc：卵母细胞；Mo：成熟卵细胞；标尺 100 μm。
FITC: Green fluorescent signal, DAPI: Blue fluorescent signal; Sg: Spermatogonium; Sc: Spermatocyte; Sz: Spermatozoon; Og: Oogonium; Oc: Oocyte; Mo: Mature oocyte; Scale bar 100 μm.
图7ScDmrt5-2 蛋白在缢蛏精巢、卵巢不同发育时期的荧光显微观察
Fig.7Fluoroscope observation of ScDmrt5-2 protein in different developmental stages of testis and ovary from S. constricta
FITC：绿色荧光信号；DAPI：蓝色荧光信号。Sg：精原细胞；Sc：精母细胞；Sz：精子；St：精细胞； Og：卵原细胞；Oc：卵母细胞；Mo：成熟卵细胞。标尺 100 μm。
FITC: Green fluorescent signal; DAPI: Blue fluorescent signal; Sg: Spermatogonium; Sc: Spermatocyte; Sz: Spermatozoon; St: Spermatid; Og: Oogonium; Oc: Oocyte; Mo: Mature oocyte. Scale bar 100 μm.
荧光显微观察结果显示，在雌、雄性腺的生长期和成熟期中，ScDmrt5-1 蛋白在精巢中的信号要强于同时期卵巢（图6）。ScDmrt5-2 蛋白在精巢各个时期的阳性信号均强于同时期卵巢，且在精巢成熟期信号最强，而在卵巢各个发育时期的信号均较弱（图7）。
3 讨论
Dmrt 基因家族是一类与动物性别分化、性腺发育相关的转录调控因子，同时也参与胚胎发育、器官功能维持等生命活动，所编码蛋白均具有高度保守的 DM 结构域，以锌指方式与特异 DNA 序列结合来调控下游基因表达（Hildreth et al，1965; Shen et al，1988）。目前已在贝类中鉴定出多个 Dmrt 基因家族成员，而不同物种的成员种类和数目不尽相同，如太平洋牡蛎有 Dsx 和 Dml（张娜等，2015），华贵栉孔扇贝有 Dmrt2 和 Dmrt5 （Shi et al，2014），马氏珠母贝有 Dmrt2、 Dmrt3、Dmrt4 和 Dmrt5（于非非等，2009），三角帆蚌有 Dmrt1（郭鹏飞，2019）、Dmrt5-1 和 Dmrt5-2 （葛静远，2020）等。Wang 等（2012）通过不同物种的氨基酸序列比对，将 Dmrt 分为 2 类：一类只含有 DM 保守结构域，另一类含 DM 和 DMA 保守结构域。其中， Dmrt1~Dmrt7 均具备 DM 结构域，而 Dmrt3、Dmrt4 和 Dmrt5 还具备 DMA 结构域（Zarkower，2001; 张月圆等，2013）。因此，可通过检测 DM 或 DMA 结构域中特异的氨基酸保守位点对 Dmrt 基因家族成员进行鉴定。在本研究中，缢蛏 2 个 Dmrt5 基因编码的蛋白除具备 DM 结构域以外，ScDmrt5-1 还具备 CUE_DMA 结构域，ScDmrt5-2 具备 UBA_like_SF superfamily 结构域。其中，CUE 结构域是 UBA 结构域家族的一个亚型，UBA_like_SF superfamily 结构域中包括 CUE_ DMA 结构域（Bayer et al，2020）。由此可见，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 均属于含 DM 和 DMA 结构域的家族成员，但保守功能域的位置有所差异。研究表明，Dmrt4 和 Dmrt5 基因同源性很高，可能起源于共同的祖先基因 Dmrt4/5（Wexler et al，2014）。在非洲爪蟾（Xenopus laevis）和三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）中，Dmrt4 和 Dmrt5 基因的染色体片段具有高度相似性，可能是由共同祖先染色体发生了重复、分化而来（Xia et al，2009）。在系统进化分析中，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 均先与硬壳蛤、菲律宾蛤仔等双壳贝类的 Dmrt5 聚为一小支，它们的 motif 位置相近且种类一致，并且氨基酸一致性均在 50%以上，缢蛏 2 个 Dmrt5 蛋白均与双壳贝类 Dmrt5 表现出高度的相似性，而与 Dmrt4 距离相对较远。然而，这 2 个基因虽然定位在同一条染色体上，但距离相对较远，表明二者还是存在一定差异，因此将其分别命名为 ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2。
Dmrt5 作为 Dmrt 家族中的重要一员，在动物的性别决定、性腺发育中发挥着重要作用（于红等，2023; 汪海等，2012）。在哺乳动物中，Dmrt5 在人精巢中特异性表达，而在小鼠精巢、卵巢中均有表达（汪海等，2012）；在斑马鱼中，Dmrt5 基因仅在精巢、卵巢和脑中特异性表达，且在精巢中的表达量高于卵巢，尤其在精原细胞、精母细胞、精子细胞和精细胞中表达量较高，故此推测 Dmrt5 基因主要参与性腺发育和精子发生（Guo et al，2004）；Dmrt5 基因在金钱鱼胚胎的各个发育时期均有表达，且在精巢各个时期的表达量均高于同时期卵巢，表明 Dmrt5 基因可能在精巢发育过程中发挥更为重要的作用（古皓天等，2019）；在马氏珠母贝中，Dmrt5 基因在精巢发育早期、成熟期的表达量均显著高于精巢其他发育时期，推测其可能主要参与精巢发育和功能维持（Wang et al，2018），与本研究结果一致。在缢蛏性成熟期，雌、雄性腺饱满，正是精子、卵子发育的关键时期，而此时 2 个 Dmrt5 基因均在精巢中的表达量显著高于卵巢，推测其可能在精巢发育和精子发生中发挥更为重要的作用。在缢蛏性腺不同发育时期中，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 基因/蛋白在精巢、卵巢各个发育时期均有表达，其蛋白均定位在雌、雄性腺生殖细胞中，表明这 2 个基因均与雌、雄性腺发育及功能维持有关。其中，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 基因/蛋白的表达量均随着精巢不断发育成熟而逐步升高，而其在卵巢中的变化趋势不明显且无规律。由此可见，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 可能均参与调控两性性腺的发育，但发挥的作用有所差异，可能在精巢发育和功能维持中发挥更为重要的作用。然而，Dmrt5 基因在其他物种性腺发育中的表达模式却有很大不同。在香鱼（Plecoglossus altivelis）性腺不同发育时期中，Dmrt5 在卵巢中特异表达，推测其对卵巢发育具有重要作用（Xue et al，2021）；在三角帆蚌中， Dmrt5-1 和 Dmrt5-2 基因及蛋白在卵巢中的表达量均高于精巢，认为其可能在雌性性腺分化、成熟期雄性性腺功能的维持中发挥重要作用（葛静远，2020）。由此可见，Dmrt5 基因可能均参与贝类雌、雄性腺的发育与相关功能维持，但在不同物种中的表达方式有所不同，具体调控机制有待进一步研究。
Dmrt5 基因除了在性腺中表达外，还在其他非性腺组织中表达，参与神经和感觉器官的分化和发育。在脊椎动物中，Dmrt5 基因在金钱鱼（古皓天等，2019）、香鱼（王金华，2014）、小鼠（Madrigal et al，2023）脑中高表达，推测其可能对脑的发育具有重要作用；在热带爪蟾（Xenopus tropicalis）中，Dmrt5 在发育中嗅叶的表达量较高，推测其可能是嗅觉系统神经形成的重要转录调控因子（Parlier et al，2013）；在成体斑马鱼中， Dmrt5 基因可能参与下丘脑–垂体–性腺轴的形成（Guo et al，2004），表明其可能与神经系统发育、神经调节有关。本研究中，缢蛏 2 个 Dmrt5 基因在外套膜、鳃、水管、肝胰腺、斧足等非性腺组织中均有表达，这与华贵栉孔扇贝（Shi et al，2014）、长牡蛎（Zhang et al，2014; 张娜等，2015）、马氏珠母贝（于非非等，2009）、三角帆蚌（葛静远，2020）等结果基本一致，表明 Dmrt5 基因的功能是广泛且多样的，可能参与多种组织器官构建及功能维持。值得注意的是，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 基因均在鳃组织中的表达量最高，其中， ScDmrt5-1 在外套膜中的表达量也很高，仅次于鳃组织。作为低等的无脊椎软体动物，缢蛏的神经系统不发达，尚没有一个集中的神经中枢，只有脑、足、脏神经节向身体各组织器官分布出神经。鳃是缢蛏的主要呼吸器官，位于外套腔中，左右各两瓣，由无数鳃丝组成，其内分布很多微小血管和鳃神经，表面有很多纤毛，可以感知食物的大小进行滤食，参与呼吸、食物的摄取、代谢废物排出等生理过程（王如才等，2008）。此外，缢蛏的外套膜包围整个软体部，生长着无数长短不一、沿外套膜边缘排列的触手，具有保护、辅助呼吸和神经感知等功能（王如才等，2008）。由此推测，ScDmrt5-1 和 ScDmrt5-2 基因可能在缢蛏的呼吸、神经感知中发挥一定作用，但具体作用机制有待进一步研究。
