摘要
为探讨仿刺参(Apostichopus japonicus)性腺的抗疲劳功效，以仿刺参雌雄混合性腺为研究对象，采用国标等方法对其蛋白质、脂质和多糖含量进行检测，随后选择健康雄性昆明小鼠(Mus musculus)连续灌胃 4 周后，进行负重力竭游泳实验，并建立疲劳模型，计算小鼠游泳时长，检测小鼠血清及肝脏组织相关指标。研究显示，仿刺参性腺富含多种营养物质，其中，蛋白质含量最高，达(56.76±0.04) g/100 g，脂质含量为(14.65±0.13) g/100 g，多糖含量为(5.35±0.16) g/100 g。从小鼠负重力竭游泳时间来看，与空白组相比，饲喂仿刺参性腺显著提升了小鼠的运动耐力，延长了其负重游泳时间(P<0.05)。从血清指标来看，与空白组相比，饲喂仿刺参性腺的小鼠血清中尿素氮(BUN)、乳酸(LA)含量显著降低(P<0.05)，表明仿刺参性腺有助于减少负重力竭游泳小鼠体内的蛋白质分解代谢，降低运动小鼠体内乳酸(LA)的含量，缓解或者消除小鼠体内的 LA 堆积，从而起到抗疲劳的效果。此外，饲喂仿刺参性腺的小鼠血清中丙二醛(MDA)含量以及肌酸激酶(CK)活性显著降低 (P<0.05)，表明仿刺参性腺有助于清除小鼠体内自由基，保护细胞不受损伤，从而缓解疲劳。同时，小鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)活性也有所降低，进一步证实了其抗疲劳效果。从肝脏指标来看，饲喂仿刺参性腺的小鼠肝脏中 MDA 含量显著降低(P<0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽 (GSH)含量显著升高(P<0.05)，表明仿刺参性腺能增强机体的抗氧化能力，通过减少氧化应激损伤进而缓解疲劳。综上所述，仿刺参性腺具有良好的抗疲劳能力，通过降低小鼠体内疲劳相关代谢产物的含量，有效缓解了小鼠的疲劳状态；同时提高了抗氧化相关酶的活性，通过减少氧化应激损伤缓解疲劳。本研究为仿刺参性腺的高值化利用提供了科学依据，同时也为抗疲劳产品的研发开辟了新思路。
Abstract
The rapid pace of modern society has led to fatigue becoming a prevalent health problem that affects people of different age groups. Apostichopus japonicus, the only sea cucumber species cultured on a large scale, has recently experienced notable growth in its aquaculture and processing industry. However, approximately 30% of by-products are generated during processing, leading to low utilization and resource wastage. A. japonicus gonads are rich in protein, lipids, polysaccharides, and other nutrients. Studies on its activity mainly focus on antioxidants, immune regulation, and anti-hyperlipidemic effects. However, studies on its anti-fatigue efficacy are limited. Therefore, this study aimed to verify the fatigue-relieving efficacy of A. japonicus gonads. To investigate the anti-fatigue effect of A. japonicus gonads, the basic nutritional composition of the A. japonicus gonads was determined using national standard methods. Healthy male Kunming mice were randomly divided into blank and dose groups, and they performed weight-bearing exhaustion swimming experiments after continuous gavage for 4 weeks. The fatigue model was established to calculate the swimming time and examine the relevant indices of serum and liver tissues in the mice. The results revealed that A. japonicus gonads are rich in various nutrients, with the highest protein content at (56.76±0.04) g/100 g. Lipids were the second most abundant nutrient at (14.65±0.13) g/100 g, providing the necessary energy for the fertilization of the egg.Additionally, A. japonicus gonads contain a certain amount of polysaccharides at (5.35±0.16) g/100g, significantly affecting antioxidant, anti-inflammatory and anticoagulant activity. Mice experiments showed that A. japonicus gonads did not significantly affect the weight gain when comparing blank and dose groups. However, when the liver weight and index of mice were further analyzed, an increase in the liver weight and index of the dose group was observed. However, no significant difference was observed compared with the blank group, possibly because A. japonicus gonads reduced the degree of hepatocyte damage and promoted hepatic glycogen storage. A forced weight-bearing swimming test was used to assess the effect of A. japonicus gonads on the exercise endurance of mice. Mice in the dose group swam significantly longer than those in the blank group, suggesting that A. japonicus gonads enhanced the endurance and anti-fatigue ability of mice. This finding was consistent with previous studies. Further analysis of the serum-related indices revealed that urea nitrogen (BUN) and lactic acid (LA) were significantly reduced after feeding A. japonicus gonads, which may be associated with energy metabolism and reduction of protein catabolism. The reduction of LA content in the body of the exercising mice might alleviate or eliminate the LA accumulation in the mice. Additionally, A. japonicus gonads significantly reduced serum malondialdehyde (MDA) level and creatine kinase (CK) activity and increased the activity of antioxidant-related enzymes, such as superoxide dismutase (SOD), glutathione (GSH) and catalase (CAT). These changes indicated that A. japonicus gonads had good antioxidant capacity, which could effectively slow down or eliminate the mice's oxidative stress damage, thereby alleviating fatigue. In the liver-related index test, the MDA content in the livers of mice was significantly reduced after feeding A. japonicus gonads, whereas SOD, CAT activities and GSH content were significantly increased. These results further confirmed its antioxidant capacity and anti-fatigue effect. However, the anti-fatigue mechanism of A. japonicus gonads remains to be further verified through cellular and molecular experiments. The study results demonstrated that A. japonicus gonads had high nutritional value and were suitable for the development of functional and nutritionally enhanced products. According to the relevant provisions of procedures and test methods for functional evaluation of health food, A. japonicus demonstrated good anti-fatigue ability, effectively alleviating mice's fatigue state by reducing the content of fatigue-related metabolites. It can improve the vitality of antioxidant-related enzymes, alleviating fatigue by reducing oxidative stress damage. This study provides a scientific basis for the high-value utilization of A. japonicus gonads and a novel concept for the development of anti-fatigue-related health food.
Keywords
随着社会节奏的加快，疲劳已经成为常见疾病的普遍前兆现象，主要表现为注意力分散、情绪低落、体力不支、失眠等（张楠等，2024）。疲劳可能由多种因素引起，包括工作强度、体质、应急事件和季节变化等，影响着不同年龄层人群的健康（Caldwell et al，2019）。如何缓解体力疲劳，快速恢复能量成为当下研究的热点。
仿刺参（Apostichopus japonicus）是目前唯一规模化养殖的海参品种（郑童潇等，2023）。近年来，仿刺参养殖产业的扩张势头强劲，其加工产业规模也在持续扩大（曹荣等，2023）。海参加工过程中会产生约 30% 的副产物（李倩等，2022），作为仿刺参副产物之一的性腺，在加工过程中利用率低，造成了资源浪费。曹荣等（2020）分别测定仿刺参雌雄性腺的营养成分，发现仿刺参富含优质蛋白质和脂质，其中，雄性生殖腺蛋白含量高达 75.82 g/100 g，而雌性生殖腺的脂肪含量高达 15.70 g/100 g，且不饱和脂肪酸所占比例较高。刘昕等（2016）研究发现，仿刺参性腺含有丰富的多糖，其中雄性性腺中多糖含量为 6.46 g/100 g，几乎与体壁多糖含量相当。目前，关于仿刺参性腺的研究多集中在抗氧化（Wang et al，2022）、调节免疫作用（李倩等，2023）及抗高血脂作用（Yang et al，2022）等方面。以上研究成果表明，仿刺参性腺营养丰富，适合开发功能性产品和营养强化型产品。但目前涉及仿刺参性腺抗疲劳功效的研究报道较少。
本研究以仿刺参雌雄混合性腺为原料，测定其基本营养组成，并通过小鼠（Mus musculus）灌胃实验分别测定其负重游泳时间、血清生化指标、肝脏生化指标等，验证仿刺参性腺的缓解疲劳功效，旨在为仿刺参性腺的高质化利用与产品开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
仿刺参性腺由山东青岛海滨食品有限公司提供，系 2023 年春季采捕仿刺参时现场分拣并分装于样品袋中，立即于–50℃条件下冷冻。
岩藻聚糖硫酸酯标准品（纯度>99%）购于 Sigma 公司，浓硫酸、浓硝酸、95%乙醇、NaOH、无水乙醚、石油醚等均为分析纯。
SPF 级昆明种雄性成年小鼠，体重为 18~22 g，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司。
尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）测试盒、乳酸（lactic acid，LA）试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDA）试剂盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。
分离胶促凝管、EP 管、灌胃针、注射器、负重铅皮、温度计、眼科剪、眼科镊、解剖剪、96 孔培养板等，购于青岛阿贝特仪器科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（Ohaus 公司，美国）；G50 型组织研磨器（卡尤迪生物科技有限公司）；Spectra Max i3x 酶标仪（Molecular Devices 公司，美国）；DHG-9423A 型电热恒温鼓风干燥箱（ 上海精宏设备有限公司）； UV-2802 型紫外/可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；5810R 型冷冻离心机（Eppendorf 公司，德国）； KDN-08C 型定氮仪/数显温控消化炉（上海新家仪器有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 基本营养成分测定
采用凯氏定氮法测定蛋白质含量，参照 GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；采用索氏提取法测定脂质含量，参照 GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》；采用高温灼烧法测定灰分，参照 GB 5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》；参照常耀光（2010）的方法测定多糖含量。
1.3.2 动物实验
1）样品制备
仿刺参性腺真空冷冻干燥处理，然后研磨成粉末，贮藏于–50℃冰箱内备用。
2）小鼠分组与适应性饲养
实验共选取 40 只 SPF 级昆明种雄性成年小鼠，体重为 18~22 g，在温度为 20~25℃，相对湿度为 40%~70%，换气次数为 10~20 次/h，光照为 12 h 明暗交替的环境下，适应性饲养 1 周，饲养期间正常进食。
3）小鼠饲喂
将饲养后的小鼠随机分为空白组和剂量组，每组 20 只。剂量组小鼠的灌胃剂量按 5.2 mg/（g·d）剂量给药，灌胃体积为 0.2 mL/10 g，每周测定小鼠体重，根据体重换算小鼠灌胃体积；空白组灌胃蒸馏水。连续灌胃 4 周，饲喂结束后，测定各项指标。
4）小鼠负重力竭游泳实验
末次饲喂 1 h 后，小鼠称重，尾根部负荷 5%体重铅皮，置于游泳箱中[约 50 cm×50 cm×40 cm，水温为（25±1）℃，水深约 30 cm]游泳，至小鼠沉入水面后立即捞起，以免小鼠淹死。准确记录自游泳开始至沉入水面时间，记为小鼠负重游泳时间（min）。
5）肝脏指数测定
将肝脏用生理盐水清洗干净，并用滤纸擦去表面水分，称取肝脏重量，并计算肝脏指数。
6）血清生化指标检测
2 组小鼠均负重游泳 10 min，休息 1 h 后，眼球采血，不加抗凝剂。将血液分别置于 4℃冰箱中约 3 h，待血凝固后 2 000 r/min 离心 15 min，取上层血清，–80℃保存备用。按照试剂盒说明书步骤分别测定 BUN、LA 和 MDA 含量，LDH 和 CK 活性。
7）肝脏生化指标检测
取血后将小鼠脱颈处死，无菌环境下摘取肝脏，用 4℃预冷生理盐水清洗，并准确称重。然后加入 9 倍体积的生理盐水，冰浴条件下用组织研磨器打碎， 2 500 r/min 离心 15 min，取上清液。按照试剂盒说明书步骤分别测定 SOD、CAT 活性和 T-GSH、MDA 含量。
1.4 数据处理
使用 Microsoft Excel 2021 进行数据统计，使用 SPSS 软件的 Duncan 法进行组间差异显著性分析， P<0.05 表示差异具有统计学意义。小鼠实验结果为 20 个样本的平均值，所有结果以平均值±标准差（x± SD）表示。
2 结果与分析
2.1 仿刺参性腺的基本营养组成分析
研究表明，仿刺参性腺的营养成分与其生理功能紧密相关（张健等，2013）。蛋白质是仿刺参性腺的主要成分，其含量为（56.76±0.04）g/100 g；其次是脂质，含量为（14.65±0.13）g/100 g，其为受精卵提供生命所需的能量（曹荣等，2020）。灰分含量为（10.26±0.19）g/100 g，多糖同样是仿刺参中重要的营养成分，具有抗氧化、抗炎症以及抗凝血等多种功效活性（Xu et al，2018）。
2.2 仿刺参性腺对小鼠体重及肝脏指数的影响
小鼠体重的波动是评估仿刺参性腺对其健康状况影响的重要指标。体重变化过快或过多均可能对小鼠健康产生不利影响。本研究中，空白组与剂量组小鼠初始平均体重分别为（19.99±0.37）g 和（20.83±0.65）g，经过 4 周饲喂后，各组小鼠日常活动与精神状态均正常，小鼠体重变化见图1。从图1可以看出，空白组与剂量组体重分别增至（40.52±2.40）g 和（41.49±3.03）g。 2 组小鼠体重增长趋势相近，无显著性差异（P>0.05）。
已有研究发现，当机体进行高强度运动时，会造成肝细胞的损伤（Chen et al，2019; Yang et al，2023）；同时肝脏在机体剧烈运动的时候会消耗大量能量，肝脏中糖原分解，肝组织缩小，可间接反映疲劳程度（邵明月，2023）。因此，本研究分析了小鼠的肝脏重量和肝脏指数，结果见表1。从表1可以看出，与空白组相比，剂量组小鼠的肝脏重量和肝脏指数有所上升，但二者无显著性差异（P>0.05），其原因可能是剂量组饲喂仿刺参性腺后小鼠肝细胞损伤程度降低，且体内多余的能量转化为肝糖原储存，高强度运动时剂量组的肝糖原消耗较空白组慢，导致剂量组肝糖原含量高于空白组，因而肝组织缩小程度低于空白组。
图1小鼠体重变化
Fig.1Weight change of mice
表1小鼠肝脏重量及肝脏指数测定结果
Tab.1Results of liver weight and liver index in mice
注：同一列数据标注不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。
Note: The data marked with different lowercase letters in the same column are significantly different (P<0.05) . The same below.
2.3 仿刺参性腺对小鼠负重力竭游泳实验的影响
游泳是小鼠的本能求生运动方式，负重力竭游泳能充分发挥小鼠的运动能力，从而客观判断小鼠运动耐力情况（You et al，2012）。何传波等（2017）将海参内脏酶解得到酶解物，饲喂小鼠后发现其可以显著增加小鼠的负重游泳时间，从而起到抗疲劳的效果。实验空白组与剂量组的游泳时长分别为（11.77±1.44）min 和（17.84±2.01）min。与空白组相比，剂量组能够显著延长小鼠的负重游泳时长，该组小鼠游泳时长显著高于空白组（P<0.05），这表明饲喂仿刺参性腺有助于增加小鼠的耐力水平，仿刺参性腺具有良好的抗疲劳作用；与何传波等（2017）的研究结果基本一致。
2.4 仿刺参性腺对小鼠血清生化指标的影响
血清相关指标检测结果见表2。血清尿素氮（BUN）是反映肌肉耐力的重要参数（郑元元，2018）。运动过程中机体需要更多能量供给，可能导致蛋白质加速代谢以满足能量需要；BUN 是蛋白质分解产生的重要代谢产物，当 BUN 浓度升高时表明蛋白质分解增加，能量供应状态受到影响，导致疲劳发生（Wang et al，2014）。与空白组相比，饲喂仿刺参性腺的小鼠其血清中 BUN 含量显著降低（P<0.05），为（8.87±0.58）mmol/L。这可能与仿刺参性腺在小鼠体内参与能量代谢，从而减少小鼠体内蛋白代谢有关。
乳酸（LA）是组织无氧代谢的产物，是判断疲劳程度的重要指标（肖刚等，2017）。剧烈运动时肌肉糖酵解反应加速产生大量乳酸（Shen et al，2021）。乳酸水平升高时会降低肌肉工作环境的 pH 值，肌肉中 LA/H+浓度异常是造成肌肉疲劳的主要原因（Geng et al，2017）。饲喂仿刺参性腺的小鼠，血清中乳酸的含量为（5.20±0.82）mmol/L，显著低于空白组（P<0.05），说明饲喂仿刺参性腺可以显著降低运动小鼠体内乳酸的含量，缓解或者消除小鼠体内的乳酸堆积，从而起到抗疲劳的效果。Yu 等（2020）研究发现，海参中分离的多肽可以降低小鼠血清中乳酸水平，从而起到抗疲劳的作用。此外，已有研究证明，仿刺参性腺同样富含多肽（李良康等，2024）。因而，饲喂仿刺参性腺组小鼠的乳酸含量下降可能与仿刺参性腺中的多肽类功效成分有关。
丙二醛（MDA）是机体中的自由基攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化反应而产生的一种有害物质。MDA 具有细胞毒性，能加剧膜的损伤，引起蛋白等生物大分子的交联聚合，从而导致细胞功能障碍（Jridi et al，2017）。付雪媛等（2016）研究认为，海参极性脂质可改善小鼠的抗氧化能力，其中有代表性的表现为 MDA 含量减少。饲喂仿刺参性腺的小鼠，其血清中 MDA 的含量为（13.61±2.49）nmol/mL，较空白组明显降低，二者有显著性差异（P<0.05），这可能是因为仿刺参性腺中脂质含量丰富，极性脂质如甘油磷脂（王天雪等，2024）占有很大比例，这些极性脂质可显著降低机体 MDA 含量。
肌酸激酶（CK）主要存在于机体的心脏和肌肉等组织的细胞浆和线粒体中，血清中 CK 活性的变化可以反映骨骼肌的损伤情况。血清中 CK 活性升高，提示肌肉损伤和机体疲劳（朱菊辉等，2023）。饲喂仿刺参性腺的小鼠，其血清中 CK 活性为（0.50±0.15）U/mL，较空白组显著降低（P<0.05），下降了 38.27%。研究表明，机体在剧烈活动时，氧化应激反应使得骨骼肌局部出现代谢产物和自由基堆积，其能攻击细胞膜和线粒体膜，导致骨骼肌细胞中 CK 释放至血液中，使血液中 CK 活性升高（陈慧婵，2014）。饲喂仿刺参性腺后小鼠 CK 活性降低，这可能是饲喂仿刺参性腺后小鼠机体抗氧化能力提高，清除了堆积在骨骼肌局部的自由基，保护细胞不受损伤，从而减少细胞中的 CK 释放至血液。
血清乳酸脱氢酶（LDH）可用于表示细胞损伤后释放到血液中的 LDH 水平，反映运动或疲劳状态下的细胞损伤情况。余毅豪（2021）将海参水解得到海参肽，发现海参肽可以减轻运动疲劳时肌肉损伤的程度，表现之一为小鼠血清中的 LDH 活性降低。饲喂仿刺参性腺的小鼠血清中 LDH 的活性较空白组明显降低，为（496.99±9.10）U/L；可能与海参花中多肽成分相关。
2.5 仿刺参性腺对小鼠肝脏生化指标的影响
在疲劳的状态下，小鼠机体的抗氧化能力也会有一定程度的影响，使得机体清除自由基的能力降低，导致 MDA 过量蓄积，SOD、CAT 活性和 GSH 含量下降，从而影响细胞正常代谢，造成机体组织损伤。
MDA 在肝脏中蓄积会导致肝脏细胞代谢失调，进而导致肝组织损伤。SOD 是一种可以清除体内超氧自由基的酶，可以将超氧自由基转化为 H2O2，阻断氧自由基对细胞造成的损伤（张向荣等，2012）。GSH 作为一种重要的抗氧化剂，在生物体内发挥着清除自由基、保护细胞免受氧化损伤的关键作用。表3是肝脏相关指标检测结果。与空白组相比，饲喂仿刺参性腺的小鼠肝脏中 MDA 含量明显降低，为（9.58±1.45）nmol/mg prot。 SOD 活性和 GSH 含量分别为（98.69±2.07）U/mg prot 和（1092.22±10.92）µmol/L，较空白组显著升高（P<0.05）。因此，饲喂仿刺参性腺可以有效地降低小鼠肝脏组织中的 MDA 含量，提高肝脏组织中 SOD 活性和 GSH 含量，表明仿刺参性腺具有良好的抗氧化能力，可以有效减缓或者消除机体出现氧化应激损伤，进而缓解疲劳的发生，与吴国宏（2016）的研究结果一致。
表2血清相关指标检测结果
Tab.2Test results of serum related indexes
CAT 是肝脏发挥抗氧化、解毒等作用的物质基础。CAT 能够清除体内的 H2O2，防止其进一步反应生成自由基，从而有助于减少氧化应激对细胞的损伤。从表3可以看出，饲喂仿刺参性腺的小鼠，其肝脏中 CAT 的活性为（14.67±0.25）U/mg prot，较空白组有所升高。Guo 等（2021）从海参中提取得到硫酸化岩藻糖，发现海参硫酸化岩藻糖可以显著提高小鼠肝脏中 CAT 的活性，增强小鼠抗氧化的能力。因此，饲喂仿刺参性腺使小鼠肝脏 CAT 活性升高，可能与仿刺参性腺中多糖促进了 CAT 的生成有关。但仿刺参性腺在细胞水平以及分子水平的抗疲劳相关研究还有待进一步实验验证。
表3肝脏相关指标检测结果
Tab.3Detection results of liver related detection indexes
3 结论
综上所述，仿刺参性腺基本营养组成丰富，其中蛋白质含量最高达（56.76±0.04）g/100 g，脂质含量次之，为（14.65±0.13）g/100 g，灰分含量为（10.26± 0.19）g/100 g，多糖含量为（5.35±0.16）g/100 g。各组实验小鼠灌胃期间精神状态良好，小鼠体重以及脏器指数均正常，说明 4 周仿刺参性腺灌胃对小鼠的体重生长与精神状态以及重要脏器指数均无显著影响。与空白对照组相比，饲喂仿刺参性腺的小鼠，其负重力竭游泳时间显著提高（P<0.05），血清中 BUN、LA、 MDA 含量显著降低（P<0.05），CK 活性显著降低（P<0.05），LDH 活性降低（P>0.05）。肝脏中 MDA 含量显著降低（P<0.05），SOD 活性和 GSH 含量显著提高（P<0.05）。根据《保健食品功能学评价程序和检验方法》规定，若 1 项以上（含 1 项）的运动实验和 2 项以上（含 2 项）的生化指标为阳性，可判定该受试物具有抗疲劳作用。由此可以判定，饲喂仿刺参性腺可显著提高小鼠的抗疲劳能力，其对机体产生的疲劳有良好的改善作用。
