摘要
病毒性偷死病(viral covert mortality disease, VCMD)是由偷死野田村病毒(covert mortality nodavirus, CMNV)引起的养殖对虾病毒性疾病。为评估虾类养殖过程中 VCMD 发生的风险，本文结合德尔菲法、层次分析法和多指标综合体系评价法，首次构建虾类养殖过程中 VCMD 发生的风险评估模型。风险评估指标体系包括 1 个目标层(病毒性偷死病发生)，5 个准则层(健康状况、水质水温、养殖模式、养殖管理和环境状况)和 20 个指标层(偷死野田村病毒感染、甲壳软、空肠空胃、腹节不透明、溶氧等)；5 个准则层风险因素权重值集合为 W={0.420，0.127，0.094，0.214，0.146}。其中，指标层风险因素中偷死野田村病毒感染(0.173)、养殖密度(0.095)、腹节不透明(0.086)和甲壳软(0.084)等 4 个指标权重值较高，推测是影响 VCMD 发生的高风险因素。以山东 3 家凡纳对虾 (Penaeus vannamei)工厂化养殖场为例，运用多指标综合体系评价法对该模型进行验证，得出 3 家凡纳对虾养殖场发生 VCMD 的风险概率分别为 0.550、0.508、0.466，均为 VCMD 发生的高风险。该结果与实际监测结果相吻合，说明该模型可用于 VCMD 发生的风险估算，并对 VCMD 的防控起到早期预警作用。
Abstract
Viral covert mortality disease (VCMD), caused by the covert mortality nodavirus (CMNV), is a highly prevalent viral infection affecting the majority of cultured shrimp. Shrimp with this disease exhibit clinical soft shells, hepatopancreatic atrophy and necrosis, empty stomachs and guts, and slow growth. During the acute infection stage, infected shrimp display opaque abdominal muscles. Farmers have observed daily mortalities in the diseased population, with mortality rates increasing between 60 and 80 days post-stocking and reaching cumulative mortalities up to 80%. CMNV can infect major cultured crustaceans, including Penaeus vannamei, P. chinensis, Marsupenaeus japonicus, P. monodon, and Macrobrachium rosenbergii, as well as fish, sea cucumber. The prevalence of VCMD has resulted in considerable economic losses within the shrimp farming industry over the past decade. Recognizing its threat to the aquaculture animals and substantial economic impact on Asian shrimp farming operations, the World Organization for Animal Health has recently issued CMNV infection as an emerging disease in aquaculture. The occurrence of VCMD in shrimp is closely related to factors such as positive CMNV infection, culture density, and culture environment. After shrimp are infected with CMNV, the disease usually occurs when the water temperature is high and the environment changes sharply. However, accurately determining the extent to which each factor is associated with VCMD occurrence remains challenging. Therefore, this study aimed to assess the risk of VCMD occurrence during shrimp culture by establishing a comprehensive risk assessment framework using the Delphi method, analytic hierarchy process, and multi-objective comprehensive evaluation. The evaluation index system consisted of 1 target level (risk assessment and early warning of VCMD occurrence), 5 criterion layers (including health status, water quality and temperature, culture mode, culture management, and environmental status), and 20 indicator layers (including CMNV infection, soft shell, empty stomach and guts,, opaque abdominal muscle, dissolved oxygen, ammonia nitrogen, nitrites, pH value, water temperature, factory culture, greenhouse culture, high-altitude tank culture, soil pond culture, breeding density, compound feed, frozen bait, fresh food, surrounding disease, facility isolation, and water treatment). The relative weight and absolute weight of each risk indicator in the risk assessment framework of VCMD occurrence were calculated based on expert scoring results. The total matrix consistency ratio was CR < 0.1, which passed the overall consistency test. The weight values of five criterion-level risk factors were W= {0.420, 0.127, 0.094, 0.214, 0.146}. The high weight values of risk factors, including CMNV infection (0.173), culture density (0.095), opaque abdominal muscle (0.086), and soft shell (0.084), indicated that these factors might be crucial for the incidence of VCMD in shrimp culture. Then, the results were preliminarily validated by studying the case of three shrimp farms in Shandong Province with methods of multiple objective comprehensive evaluation. The risk values of VCMD occurrence in these three shrimp farms were determined to be 0.550, 0.508, and 0.466, all indicating a high risk of VCMD outbreak. Consistently, within 4 days after monitoring and sampling activities, severe cases of VCMD occurred in all three farms with a mortality rate exceeding 80%. These findings demonstrate that the risk assessment results align with the monitoring results and confirm the accurate early warning capabilities of the model for assessing VCMD occurrence. In summary, this study established a convenient and feasible risk assessment model for VCMD occurrence in shrimp culture. The risk assessment model comprehensively considers various factors that contribute to VCMD occurrence during the culture process, ensuring accurate assessment results. This research suggests that the proposed risk assessment model could be used to estimate the risk of VCMD occurrence in shrimp culture and could serve as an early warning tool for prevention and control, thereby ensuring the healthy and sustainable development of shrimp farming.
病毒性偷死病（viral covert mortality disease，VCMD）是偷死野田村病毒（covert mortality nodavirus，CMNV）引起的养殖对虾病毒性疾病（Xu et al，2020; Zhang et al，2014）。该病毒主要感染甲壳类，也可感染鱼类和棘皮类等水产养殖动物，在亚洲、中南美洲和非洲等全球主要水产养殖地区均有流行，对水产养殖业造成严重威胁（Wang C et al，2019、2021、2022; Zhang et al，2019; Xu et al，2021、2022; 赵文秀等，2024）。2020 年，亚太水产养殖中心网络（network of aquaculture centers in Asia-Pacific，NACA）发布 VCMD 的疾病诊断卡，提供了 VCMD 病原学、流行病学及疾病诊断等基本信息。2023 年世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health，WOAH）将 CMNV 感染列为水产新发病害，向全世界发出该病原危害预警。
VCMD 的发生与虾苗是否带毒、养殖密度、养殖环境等因素密切相关。对虾感染 CMNV 后，通常在水温较高（28℃以上）和环境急剧变化时发病，患病对虾表现出空肠空胃，甲壳变软，肝胰腺萎缩、颜色变浅，腹部肌肉不透明或者发白等临床症状（Zhang et al，2014）。但是，每一因素与 VCMD 发生的关联有多大，如何评估，目前还没有准确可靠的方法。
动物疫病风险分析是指对某种动物疫病传入、定居和扩散的可能性及其后果进行评估管理和交流的方法和过程。动物疫病风险评估作为疫病风险分析过程中的核心步骤，在疾病的早期预警、预防及制定有效防控措施中发挥着关键作用（梁鹏达，2019）。目前，我国已经建立了十多种水生动物疾病发生的风险评估模型，包括石斑鱼虹彩病毒病（grouper iridovirus disease）、草鱼出血病（hemorrhage of grass carp）、鲤春病毒血症（spring viremia of carp）、牡蛎弧菌病（oyster vibriosis）、罗非鱼湖病毒病（tilapia lake virus disease）等（王姝等，2012; 杨淞等，2012; 林强等，2017; 马红玲等，2019; 郑晓聪等，2020），但尚未见针对养殖对虾疫病发生风险评估的报道。本研究综合考虑养殖环境、养殖密度和养殖模式等多种因素，对虾类工厂化养殖过程中 VCMD 发生风险进行评估，筛查了影响 VCMD 发生的主要风险因素，并建立了基于层次分析法的 VCMD 发生风险评估模型，以期为虾类 VCMD 早期预警提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 风险因素的确定
基于 VCMD 相关文献，并结合流行病学调查中掌握的疾病发生特点，罗列影响虾类感染 CMNV 的相关风险因子。同时，根据现场调查、经验判断、专家咨询、专家评议和风险矩阵分析等方法，识别并确定了影响工厂化养殖场 VCMD 发生的风险因素。归纳总结后，确定虾类感染 CMNV 相关风险因子有甲壳软、空肠空胃、腹节不透明、养殖密度、养殖模式等。
1.2 基于层次分析法建立风险评估模型
1.2.1 风险指标体系的构建
层次分析法是将与最终结果相关的若干评价因子自上而下、逐级分解成一个目标层、多个准则层及若干指标层，并进行定性和定量分析的决策方法。将上述筛选出的风险因素构建相互关系的集合，采用层次分析法，构建一个养殖对虾 VCMD 多层次风险指标体系，将上述风险因素分解成 1 个目标层、5 个准则层和 20 个指标层。在此基础上进行半定量分析的模型构建。本研究中的指标体系包括 1 个目标层（A）、5 个准则层（B1~B5）和 20 个风险指标层（C1~C20）（图1）。
1.2.2 风险因子权重确定
采用德尔菲法对相关风险指标建立判断矩阵（孙振球等，2002）。本研究以调查问卷方式咨询了 8 名对虾病害专家（来自科研院所和高校）、8 名水产技术推广专家（来自全国和省市级推广机构）和 6 名具有 20 年以上虾类养殖经验的从业者，由其对风险权重进行打分。在比较两个因素的重要性时，采用 Satty 提出的 1~9 标度法，1 表示同等重要，3 表示稍微重要，5 表示相对重要、7 表示重要，9 表示非常重要（Saaty，1977）。然后通过判断矩阵求解出各风险指标的相对权重值和绝对权重值。
1.2.3 风险因子风险等级的划分
根据求解出的各风险指标的绝对权重值（W），本研究设定 V={V1、 V2……Vn}为 VCMD 发生的风险等级集：
0.10 ≤W＜0.20 为高危风险 V1；
0.05 ≤W＜0.10 为高风险 V2；
0.02 ≤W＜0.05 为中度风险 V3；
W＜0.02 为低风险 V4。
1.2.4 风险指标量化
根据对虾养殖过程中 VCMD 风险评估量化分析要求，结合发病的流行病学特点、文献调研、专家咨询等，构建各项评估指标的量化评分标准。风险评估指标的量化包括定性指标的量化和定量指标的量化。定量指标是指风险因子中能够用数字表示的，定性评估指标是指在判断其危害影响时，不能直接用数字表示的。
根据文献资料和专家经验，采用 3 个等级评分标准对定性指标赋值，分别表述为“高、中、低”3 个风险等级，对应分值为 1、0.5、0（表1、表2）。根据危害识别细化原则对定量指标进行 4 个等级评判标准的量化（彭自然等，2004; 索建杰等，2015），4 个等级分别为高、较高、中、低，其对应的风险量化值为 1、 0.75、0.5、0.25，各指标的详细说明见表3。
1.2.5 VCMD 发生风险的计算
按照上述评分标准对各风险因素进行赋值，然后与其权重进行加权平均，得到风险评价的总分值（P），即为 VCMD 发生的概率，其多指标综合评价函数为：
式中，P 是 VCMD 发生风险的概率；Xi 是第 i 个子风险因素赋值结果；Ri 是第 i 个子风险指标的绝对权值； n 是子风险因素的数量。P 值越大，说明风险越大，反之则越小。为了使风险评估模型的结果能够发挥预警作用，本研究中将风险发生概率 P 量化为 P=（高风险，中风险，低风险）=（0.50，0.35，0.20）3 个风险等级。即假定当 P∈（1.00，0.50）时，对应的评价结果为“高风险”，当 P∈（0.20，0.35）时，评价结果为“中风险”，当 P∈（0，0.20）时，评价结果为“低风险”。
1.3 监测对虾工厂化养殖场验证模型
1.3.1 模型计算养殖场内 VCMD 发生风险概率
对山东 3 个凡纳对虾（Penaeus vannamei）工厂化养殖场的水质水温、养殖模式、养殖管理、环境状况和养殖对虾的健康状况展开调查。按照风险指标量化标准对养殖场内各风险指标进行赋值，然后根据风险评估指标体系中各风险因素的绝对权重，利用多指标综合评价函数计算 VCMD 发生的概率。
图1病毒性偷死病发生风险指标体系
Fig.1Risk index system of viral covert mortality disease occurrence
表1定性风险指标赋值说明
Tab.1The description of qualitative risk indices
注：括号内数字为指标赋值。表2、表3 同。
Note: Data in brackets in the first row are the values of the indices. The same in Tab.2 and Tab.3.
表2VCMD 发生过程中养殖模式相关养殖密度（C14）风险指标分级标准/（尾/m3）
Tab.2The grading standards for risk indices of culture density (C14) related to culture model during the occurrence of VCMD/ (ind./m3 )
注：密度数据采集自养成期 3 cm 对虾。
Note: Density data were collected from 3 cm shrimp during the cultivation period
表3定量风险指标赋值说明
Tab.3The description of quantitative risk indices
1.3.2 实际监测养殖场内 VCMD 发生情况
跟踪 3 个工厂化养殖场内养殖对虾的发病情况，并从 3 个养殖场采集凡纳对虾样品 20 份。每尾个体取 40 mg 左右的肝胰腺保存于 RNALaterTM固定液（天根生化科技有限公司，北京）中，带回实验室用于组织 RNA 的提取。用镊子将保存在 RNALaterTM固定液中的样品取出放入 1.5 mL 的小管中，用电动匀浆器将其快速破碎匀浆，然后，按照 RNA 快速提取试剂盒（百泰克）说明书，提取组织样品总 RNA。最后，根据 Wang W 等（2022）报道的 TaqMan RT-qPCR 方法检测样品中 CMNV 靶基因片段。
2 结果与分析
2.1 风险指标体系的构建及权重
利用层次分析法构建了虾类 VCMD 发生的风险指标体系，该指标体系包括 5 个准则层（B1~B5）和 20 个风险指标层（C1~C20）（图1）。对 5 个准则层构建判断矩阵，根据专家打分结果，计算出各风险指标的相对权重和绝对权重（表4）。结果显示，5 个准则层风险因素的绝对权重值集合为 W={0.420，0.127，0.094， 0.214，0.146}，其中，B1 权重最高为 0.420，B3 权重最低为 0.094。上述结果表明，虾类健康状况是 VCMD 发生最重要的影响因子。此外，CR=0.017（CR<0.1），说明判断矩阵的一致性可达满意标准，且权重分配合理。
同理，分别构建健康状况 B1、水质水温 B2、养殖模式 B3、养殖管理 B4 和环境状况 B5 的指标判断矩阵（表4）。在健康状况 B1 的判断矩阵中，偷死野田村病毒感染 C1 权重最高 0.413，空肠空胃 C3 权重最低 0.179，且 CR<0.1，说明判断矩阵具有满意的一致性，权重分配合理。在水质水温 B2 的判断矩阵中，溶氧 C5 的权重最高（0.379），pH 值 C8 的权重最低（0.076），且 CR<0.1，说明判断矩阵具有满意的一致性，权重分配合理。在养殖模式 B3 的判断矩阵中，土塘养殖 C13 的权重最高 0.451，工厂化养殖 C10 的权重最低 0.114，且 CR<0.1，说明判断矩阵具有满意的一致性，权重分配合理。在养殖管理 B4 的判断矩阵中，养殖密度 C14 的权重最高 0.443，配合饲料 C15 的权重最低 0.068，且 CR<0.1，说明判断矩阵具有满意的一致性，权重分配合理。在环境状况 B5 的判断矩阵中，周边发病情况 C18 的权重最高（0.442），用水处理 C20 的相对权重最低（0.261），且 CR<0.1，说明判断矩阵具有满意的一致性。
对层次总排序（表4），结果显示，指标层风险因素中 C1 偷死野田村病毒感染（0.173）、C14 养殖密度（0.095）、C4 腹节不透明（0.086）和 C2 甲壳软（0.084）等 4 个指标权重值较高，推测是影响 VCMD 发病的高风险因素。
表4VCMD 发生的风险层次体系及各因素权重
Tab.4The risk hierarchy system of occurrence of VCMD and weights
2.2 VCMD 发生风险评估模型的验证
对山东 3 个凡纳对虾工厂化养殖场进行养殖状况监测和病原感染/携带情况分析，并利用该模型对监测结果进行了分析。3 个室内工厂化养殖场养殖对象均为凡纳对虾；养殖密度约为 600 尾/m3，属于高风险；养殖水温维持在 30℃，属于较高风险；养殖过程中使用配合饲料和冰鲜卤虫，属于中高风险；养殖用水为 300 m 地下咸水，检测无病原，属于低风险； 监测抽样时，3 家养殖场对虾发生了 5%~40%不等的空肠空胃和腹部肌肉发白的情况，属于中风险；有一家养殖场对虾发生了 30%以上的甲壳软症状，属于中高风险；周边出现了零星发病，属于中风险；3 家均无有效的隔离设施，属于高风险；养殖水质指标相对正常，均属于低风险。监测过程中共从 3 个室内工厂化养殖场抽样 20 份，使用 Taqman 探针 RT-qPCR 检测方法对上述 20 份（117~136 号）样品进行了 CMNV 携带情况检测，结果显示，所有样品中均检测到 CMNV 阳性，3 家养殖场对虾中 CMNV 阳性率均不低于 50%，属于高风险（表5）。根据上述 VCMD 发生风险预警模型，利用多指标综合评价函数计算得知，上述 3 家凡纳对虾养殖场发生 VCMD 的风险概率分别为 0.550、0.508、0.466（表6），按照风险预警的标准，均存在 VCMD 发生的高风险。本研究开展上述监测采样工作后 4 d 内，上述 3 家养殖场均发生了严重的 VCMD，死亡率超过了 80%。
3 讨论
风险评估是当前国际动物卫生评价和风险管理的重要科学工具，国内对动物卫生风险评估也越来越重视，国家已经将风险评估纳入动物卫生防疫法。风险评估分为定性风险评估、半定量风险评估和定量风险评估（范维澄等，2004）。定性风险评估是早期的一种风险评估方式，一般以“高、中、低”来表示某一事物发生的可能性。定量风险评估是对相关数据进行量化，并按照逻辑关系构建风险因子与结果之间的函数，最终以具体的数字来表示风险评估的结果（李红等，2008）。定性风险分析灵活性强，但准确性低；定量风险分析准确性高，但需要丰富的数据，构建难度大。我国水生动物疫病风险评估研究起步较晚，数据有限，且水生动物疾病的发生与多种因素相关，因此，多采用层次分析法与综合评估函数相结合的半定量方式进行风险评估。
目前，国内科研人员已针对石斑鱼虹彩病毒病、草鱼出血病、鲤春病毒血症、牡蛎弧菌病、罗非鱼湖病毒病等（王姝等，2012; 杨淞等，2012; 林强等，2017; 马红玲等，2019; 郑晓聪等，2020; 刘泽天等，2022）重要水生动物疫病开展了风险评估研究工作。杨淞等（2012）采用层次分析法构建了由 9个目标层和 26个风险指标层组成的草鱼出血病发生风险半定量评估模型。林强等（2017）基于层次分析法构建了由 3 个准则层和 13 个风险指标层组成的牡蛎养殖过程中副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染风险评估模型。刘泽天等（2022）构建的养殖石斑鱼虹彩病毒病发生风险指标体系包括 5 个准则层和 20 个风险指标层。本研究采用同样的方法，在对虾类养殖过程中 VCMD 发生原因调查和分析的基础上，紧密结合 VCMD 发生特点，利用层次分析法构建了包括 5 个准则层和 20 个指标层的虾类养殖过程中 VCMD 发生的风险指标体系。同时，对多名对虾病害专家和一线养殖者开展问卷调查，并采用德菲尔法计算了各项指标因子的权重，进行了一致性检验，保证了结果的真实可靠性。
表5RT-qPCR 检测养殖场各样品中 CMNV 拷贝数
Tab.5The copy number of CMNV in sample of farm detected by RT-qPCR
表6VCMD 发生风险评估模型在工厂化养殖场的应用
Tab.6Application of VCMD occurrence risk assessment model in factory farms
根据文献报道，VCMD 在高密度养殖的凡纳对虾中易发（Huang，2012; Zhang et al，2014）。CMNV 属于野田村病毒科（Nodaviridae），野田村病毒衣壳通常由 60 个衣壳蛋白三聚体组成，每个三聚体需要结合 3 对钙离子，衣壳蛋白组装单个病毒颗粒过程中需要结合 360 个钙离子（Ho et al，2018），由此导致患病个体在病毒的急性感染期会出现甲壳变软的情况（Liu et al，2022）。除此之外，低剂量 CMNV 的长期感染会导致患病虾肌肉组织出现坏死，工厂化养殖模式中，患 VCMD 的对虾除了甲壳变软外，急性感染期还会出现腹节肌肉不透明的现象。本研究构建的虾类 VCMD 发生的风险评估模型显示，CMNV 感染、养殖密度、腹节不透明和甲壳软 4 个指标权重值较高，结合生产实际，推测它们是影响 VCMD 发生的高风险因素。此前相关报道表明，病毒感染和养殖密度同样是石斑鱼虹彩病毒病发生的高风险因素（刘泽天等，2022）。故在水生动物病毒病防控中，应加强苗种检验检疫工作，确保养殖对虾健康不携带病毒，同时注意控制养殖密度，有效降低养殖后期 VCMD 发生的机率。
为了验证模型预测结果的准确性，本研究对山东 3 个凡纳对虾工厂化养殖场发生 VCMD 的风险进行预测，预测结果显示，3 家凡纳对虾养殖场发生 VCMD 的风险概率分别为 0.550、0.508、0.466，皆为 VCMD 发生的高风险。监测采样工作后 4 d 内，3 家养殖场均暴发了严重的 VCMD，死亡率超过了 80%。该结果表明风险结果与监测结果相吻合，模型预警结果较准确，可用于 VCMD 发生的风险评估。
综上所述，本研究建立了一个方便可行的 VCMD 发生的风险评估模型，该风险评估模型综合考虑了虾类养殖过程中 VCMD 发生的各种风险因素，得出评估结果较准确，相关养殖从业者可利用此模型进行风险评估，提高虾类 VCMD 的防控水平，助力保障虾类养殖业健康可持续发展。
