摘要
为探究 DNA 甲基化在三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)感染中的表观遗传调控机制，对三疣梭子蟹 PtRab2A 进行了基因结构、相似性、系统进化、组织表达以及血淋巴组织在副溶血弧菌感染过程中不同时间点的基因表达水平和 DNA 甲基化模式进行了研究。结果显示，该基因全长为 1824 bp，其中包括 15 bp 的 5′ UTR、822 bp 的 ORF 区域和 987 bp 的 3′ UTR，在 PtRab2A 的 C 端发现了 2 个保守的半胱氨酸残基，预测分子式为 C1322H2084N382O399S12，分子量为 30.10 kDa，理论等电点(pI)为 7.05，共编码 274 个氨基酸。PtRab2A 的保守结构域与拟穴青蟹的保守结构域相似性最高(100%)；实时荧光定量 PCR 分析显示，PtRab2A 在三疣梭子蟹各个组织中均有表达，副溶血弧菌感染下该基因的表达水平在 12 h 和 72 h 时显著升高(P<0.05)；亚硫酸氢盐(BS)-PCR 分析显示，副溶血弧菌感染 72 h 后该基因的 DNA 甲基化水平显著降低，与基因表达呈显著负相关性(P<0.05)。采用 RNAi 敲降 PtRab2A 后，其表达量显著下调， 24 h 时，敲降效率达到 80%。采用 RNAi 敲降 PtRab2A 后，注射副溶血弧菌后发现，实验组的死亡率在 2 h 时显著高于对照组，且死亡高峰期提前。因此，副溶血弧菌感染下，三疣梭子蟹可能通过 DNA 甲基化水平下调促进免疫基因的表达，从而提高其免疫力。研究结果丰富了三疣梭子蟹抵御病原入侵的分子调控机制。
Abstract
With the expansion of aquaculture and deterioration of farming environments, diseases are a major issue in Portunus trituberculatus farming, among which Vibrio parahaemolyticus is the primary pathogen causing mortality. Rab GTPases, which belong to the Rab protein family within the small GTPase Ras superfamily, play critical roles in regulating intracellular membrane trafficking in eukaryotic cells. Studies have shown that Rab enhances immunity in invertebrates against pathogenic infection by regulating phagocytosis in hemolymph tissues. DNA methylation, a common epigenetic regulatory mechanism, is involved in controlling the expression of key genes. However, the molecular mechanism by which DNA methylation regulates gene expression and thus influences the immune response of P. trituberculatus upon pathogen infection remains unclear. To explore the epigenetic regulatory mechanism involving DNA methylation in response to V. parahaemolyticus infections in P. trituberculatus, the gene structure, sequence similarity, and phylogenetic analysis of PtRab2A were characterized. In addition, the PtRab2A expression and its DNA methylation patterns in response to V. parahaemolyticus infection were investigated. Preliminary experiments were conducted with 90 randomly selected P. trituberculatus specimens, weighing approximately (30±5) g. Python was used to calculate the median lethal concentration (LC50) of V. parahaemolyticus infection at 72 h post-infection, which was determined to be 5×106 CFU/mL. This concentration was then applied in the formal experiment. A total of 40 temporarily cultured crabs were selected for the formal infection test, and hemolymph tissues were collected at 0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, and 72 h after infection for subsequent DNA methylation and gene expression analysis. The RNAi experiment was divided into two groups, each consisting of 80 individuals. At 12 and 24 h post-injection, hemolymph tissues were collected from five crabs each in both the blank control and experimental groups. Following 24 h of RNAi treatment, surviving crabs were infected with V. parahaemolyticus (5×106 CFU/mL). Mortality rates were recorded at 1-h intervals until complete mortality occurred. The results showed that the full length of PtRab2A was 1,824 bp, including a 15 bp 5′ UTR, an 822 bp ORF region, and a 987 bp 3′ UTR. Two conserved cysteine residues were identified at the C-terminus of PtRab2A. The predicted molecular formula was C1322H2084N382O399S12, with a molecular weight of 30.10 kDa and a theoretical isoelectric point (pI) of 7.05. The gene encodes a total of 274 amino acids. Homology analysis revealed that the conserved amino acid sequence of PtRab2A showed the highest similarity with that of Scylla paramamosain. SMART analysis identified a RAB domain within PtRab2A. Phylogenetic analysis using MEGA11 indicated that P. trituberculatus PtRab2A clustered most closely with S. paramamosain, and then grouped with Eriocheir sinensis. These crabs subsequently clustered with Penaeus monodon, Penaeus chinensis, and Drosophila melanogaster. Meanwhile, Homo sapiens, Mus musculus, Danio rerio, Oncorhynchus mykiss, Larimichthys crocea, Ruditapes philippinarum, and Crassostrea gigas formed another large cluster. Notably, D. melanogaster and crustaceans were grouped together, while Rab2A genes of invertebrates (excluding mollusks) such as P. trituberculatus were distinctly separated from those of vertebrates. The methylation profile of the PtRab2A gene following V. parahaemolyticus infection was analyzed using IGV visualization software. The monoclonal sequencing results were further analyzed using the QUMA online platform. After 72 h of V. parahaemolyticus challenge, the average methylation rate of PtRab2A was 40%, compared to 69% at 0 h, indicating a significant reduction in PtRab2A methylation levels. This trend was consistent with the IGV visualization results. Pearson correlation analysis revealed a correlation between PtRab2A methylation levels and gene expression levels in hemolymph tissue after V. parahaemolyticus infection, with a correlation coefficient of −1.000. This indicates a significant negative correlation between PtRab2A methylation and its gene expression levels. The RNAi results showed that the expression level of PtRab2A was significantly reduced at 12 h after injection of the interfering RNA (P<0.05), and knockdown efficiency reached 80% at 24 h. After 24 h of interference, V. parahaemolyticus was injected into both the experimental and control groups. Mortality statistics indicated that in the experimental group, the mortality rate began to increase 2–3 h after infection, rising from 34.3% to 78.1%, representing a 2.27-fold increase, with all individuals dying by 4 h post-infection. In contrast, the mortality rate in the control group did not begin to rise until 4–5 h after infection, increasing from 15.0% to 62.5%, a 4.17-fold increase, with complete mortality occurring at 6 h. These results indicate that the mortality rate in the experimental group was significantly higher than that in the control group at the same time points, and peak mortality occurred earlier in the experimental group. Therefore, under V. parahaemolyticus infection, P. trituberculatus may enhance the expression of immune-related genes by reducing DNA methylation levels, thereby improving its immune capacity. These findings enrich the understanding of the molecular regulatory mechanisms involved in the defense against pathogen invasion in P. trituberculatus.
Keywords
三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）广泛分布于中国、日本、朝鲜等沿海，具有生长迅速、营养价值高等特点，已成为海洋渔业中重要的商业品种，也是我国主要的养殖蟹类之一（Zhang Y et al，2022）。然而，随着三疣梭子蟹养殖规模的不断扩大和养殖水环境恶化导致疾病频发，给三疣梭子蟹养殖业造成巨大的经济损失。在众多病原菌中，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是引起三疣梭子蟹大量死亡的主要病原体，患病梭子蟹会出现运动迟缓、蜕皮困难等症状，并最终死亡（Li et al，2024）。
Rab（Rab GTPase）具有控制真核细胞中细胞内膜运输的功能，属于小 GTP 酶 Ras 超家族 Rab 蛋白家族（Wang et al，2015），参与细胞器调节、运输、信号转导、有丝分裂、吞噬作用、生长分化、细胞骨架蛋白解聚等活动，与基因异常表达及许多病理相关（Zhu et al，2024）。研究表明，凡纳对虾（Penaeus vannamei）Rab 对细菌、pH 值和 Cd 应激反应敏感，Rab 对细菌的敏感程度高于环境应激，在肝胰腺中表达量显著升高，说明 Rab 对细菌感染响应显著（Wang et al，2015）。血淋巴组织作为甲壳动物免疫系统的重要组成部分，在抵御细菌感染的过程中起到关键作用，中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）感染鳗弧菌后，其血淋巴组织 Rab 的表达水平显著上调，刺激 1.5 h 达到最高水平，为空白组的 7 倍（Wang et al，2013）。大量研究证明，甲壳动物血淋巴组织通过对病原菌的吞噬作用提高免疫力，日本对虾（Marsupenaeus japonicus）PjRab 被 siRNA 沉默时，副溶血弧菌的吞噬百分比和吞噬指数显著降低，表明 PjRab 蛋白在血淋巴吞噬作用中必不可少（Zong et al，2008）。
表观遗传学是指在不改变生物体 DNA 序列的前提下，致使基因表达发生可遗传变化（Jablonka et al，1998），主要包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码 RNA 活性调节（Jiang et al，2016）。DNA 甲基化是最常见的表观遗传调控机制，在维持基因组稳定性、基因激活、X 染色体失活等方面发挥重要作用（Lian et al，2015）。研究发现，病原菌感染会改变生物体的 DNA 甲基化水平，从而影响其关键基因的表达。例如，半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）arnt2、nhr38、pcdh10、 ccdc158 基因（Ma et al，2023）以及斑马鱼（Danio rerio）IL1β、Casp9（Caballero-Huertas et al，2020）等免疫相关基因 DNA 甲基化水平在病原菌感染下发生显著改变。然而，病原感染下三疣梭子蟹如何通过 DNA 甲基化调控基因表达从而影响其免疫功能的分子机制尚不明确。
本研究分析三疣梭子蟹 PtRab2A 基因的结构和系统演化，探讨 PtRab2A 在各组织中的表达分布特征和副溶血弧菌攻毒不同时间点的表达模式，进一步分析该基因 DNA 甲基化水平在 0 h 和 72 h 的变化并与表达水平进行关联，并利用 RNA 干扰技术进行 PtRab2A 的功能验证，以期为揭示三疣梭子蟹在副溶血弧菌感染下的免疫调控机制提供参考，同时从表观遗传学的角度为三疣梭子蟹抗病良种的培育提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用三疣梭子蟹取自山东省昌邑市海丰水产养殖有限责任公司。饲养至 80 日龄时，选取健康有活力、体重为（30±5）g 的三疣梭子蟹，于室内水泥池中暂养 7 d 用于后续实验，养殖海水盐度 30，pH 8.7，定时喂食新鲜杂鱼（Li et al，2022）。
暂养 7 d 后，随机选取 5 只三疣梭子蟹，取其鳃、肝胰腺、肌肉、眼柄、脑、肠、胃、心脏、胸神经节和血淋巴共 10 个组织，暂存于液氮中，用于组织表达分析。
1.2 实验方法
1.2.1 副溶血弧菌攻毒实验
随机取 90 只健康且大小一致的三疣梭子蟹进行预实验，平均分为 3 组，分别注射浓度为 1×105、1×106 和 1×107 CFU/mL 的副溶血弧菌进行预实验，根据三疣梭子蟹个体的体重确定副溶血弧菌注射量（1 μL/g）。副溶血弧菌的悬液参考以下方法制备（窦全伟等，2018），注射位置为三疣梭子蟹游泳足基部（谢建军等，2011）。使用 Python 计算得出副溶血弧菌感染 72 h 的半致死浓度为 5×106 CFU/mL，将此浓度用于正式实验。
选取 40 只暂养三疣梭子蟹进行正式实验，实验组注射浓度为 5×106 CFU/mL 的副溶血弧菌，根据三疣梭子蟹个体确定副溶血弧菌注射量（1 μL/g），注射位置为游泳足基部。取注射后 0、6、12、24、48 和 72 h 的三疣梭子蟹血淋巴组织，将血淋巴与抗凝剂 1∶1 混合，5 000 r/min 离心 10 min 并保留沉淀。每个时间点取 5 个个体，并储存在液氮中，用于后续不同攻毒时间的 DNA 甲基化分析和基因表达分析。
1.2.2 PtRab2A 基因 RNAi 实验
使用生工生物工程（上海）股份有限公司筛选的 3 个干扰靶点（表1）进行 RNAi 实验。利用 T7 RNAi Transcription Kit（Vazyme，中国）合成 siRNA 干扰序列，并稀释至 1 μg/μL。
RNAi 实验共分为 2 组各 80 个个体：实验组将 siRNA 浓度稀释为 1 μg/μL，并将 3 条干扰序列进行混合注射；空白对照组根据三疣梭子蟹个体的体重进行注射生理盐水（注射量为 1 μL/g）。在注射后 12 h、 24 h，空白对照组和实验组分别取 5 只三疣梭子蟹的血淋巴组织于液氮中保存，用于干扰效率检测。
在 RNAi 实验 24 h 后，每组取 60 个个体进行攻毒实验，按体重注射浓度为 5×106 CFU/mL 副溶血弧菌（注射量为 1 μL/g）。每隔 1 h 统计一次死亡率，直至全部死亡。
表1实验所用的双链 RNA
Tab.1The double-stranded RNA used in the experiment
1.2.3 生物信息学分析
使用 BLAST 算法（http :// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）分析 PtRab2A 的 cDNA 序列，并利用 ExPASy（https ://web.expasy.org/ translate/）推导出的氨基酸序列并对其进行序列分析；采用 SWISS-MODEL 预测算法（http ://swissmodel.expasy. org/）对 PtRab2A 的三级结构进行预测；通过 SMART4.0（http ://www.smart.emblheidelberg.de/）对 PtRab2A 的保守结构域进行预测，使用 SignalP-4.1 在线软件（https ://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）对 PtRab2A 信号肽进行分析，使用 Espript 3.0 和 MEGA1 1.0 进行序列比对并构建系统发育进化树。
1.2.4 DNA 和 RNA 提取
利用海洋动物 DNA 提取试剂盒（全式金，中国）提取不同时间点三疣梭子蟹血淋巴组织的 DNA，使用 TransZol Up Plus RNA Kit（全式金，中国）提取 RNA。通过 1%的琼脂糖凝胶检测基因完整性，利用紫外分光光度计测定 DNA 和 RNA 浓度。
1.2.5 BSP 验证
用 EpiArt DNA Methylation Bisulfite Kit（Vazyme，中国）对 DNA 进行亚硫酸氢钠处理。亚硫酸氢盐（BS）PCR 扩增引物利用 MethPrimer 软件（http ://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/ methprimer.cgi）设计，用于扩增目的序列的 PCR 引物序列见表2。热启动 DNA 聚合酶（Vazyme，中国）用于 BS PCR，PCR 体积为 40 μL：4 μL 模板，酶混合液 20 μL，上下游引物各 1.6 μL，ddH2O 12.8 μL；PCR 扩增条件：95℃，5 min；95℃，30 s；55℃，30 s；72℃， 30 s；35 个循环；72℃，10 min；4℃保存。使用凝胶纯化试剂盒（Vazyme，中国）对 PCR 产物进行凝胶纯化，并将纯化的片段连接到 pMD18-T 载体，转化到 DH5α 感受态细胞中，涂板，37℃倒置培养 12 h，随机选择 20 个单菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。利用 QUMA（http://quma. cdb.riken.jp/）在线软件对测序结果进行甲基化水平计算，通过 IGV 软件进行可视化分析。
表2实验所用的引物序列
Tab.2The sequence of primers used in the experiment
1.2.6 PtRab2A 的组织表达分析
将梭子蟹不同个体的不同组织的 RNA 利用 PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）反转为 cDNA，使用 Primer Premier 5.0 设计引物，NCBI blast 验证引物特异性，内参基因为 β-actin（表2），具体实验步骤参考 Zhang W 等（2022），使用 Python 对实验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），利用 Origin 2020 绘图，P<0.05 为差异显著。
1.3 数据处理
CG 位点的甲基化水平=甲基化的 CG 位点数目/ 总 CG 位点数目，使用 2–ΔΔCt 的方法计算基因的相对表达水平，定量数据使用平均值±标准误（Mean±SE）的形式表示。使用 Pearson 相关系数评估基因表达与 DNA 甲基化之间的相关性。
2 结果与分析
2.1 PtRab2A 的序列特征
PtRab2A 的 cDNA 全长为 1 824 bp，其中包括 15 bp 的 5′UTR，822 bp 的 ORF 区域和 987 bp 的 3′UTR，在 PtRab2A 的 C 端有 2 个保守的半胱氨酸残基（图1A），预测分子式为 C1 322H2 084N382O399S12，分子量为 30.10 kDa，理论等电点（pI）为 7.05，共编码 274 个氨基酸。 SWISS-MODEL 预测算法推测 PtRab2A 三级结构（图1B），发现存在典型的中央 6 股 β-片层（β1~6）和位于中央 6 股双层片两侧的 α-螺旋（α1~5）（图2A）。
利用 SignalP-4.1 对 PtRab2A 信号肽进行预测，发现其并没有信号肽。同源性分析发现，PtRab2A 的氨基酸保守序列与拟穴青蟹（Scylla paramamosain）的相似性最高（图2A）。通过 SMART 分析，在 PtRab2A 中发现一个 RAB 结构域（图2B）。利用 MEGA11 进行系统进化树分析发现，三疣梭子蟹 PtRab2A 与拟穴青蟹亲缘关系最近、聚为一支，然后与中华绒螯蟹聚为一支，最终与斑节对虾（Penaeus monodon）、中国对虾（Penaeus chinensis）和黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）聚为一大支；智人（Homo sapiens）、家鼠（Mus musculus）、斑马鱼、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、大黄鱼（Larimichthys crocea）、菲律宾蛤仔（Ruditapesphilippinarum）和长牡蛎（Crassostrea gigas）聚为一大支，而黑腹果蝇和甲壳动物聚为一支。三疣梭子蟹等无脊椎动物（除软体动物）与脊椎动物的 Rab2A 之间互相独立（图2C）。
2.2 PtRab2A 组织表达
PtRab2A 在三疣梭子蟹 10 个组织 qPCR 结果显示，该基因在全部组织中均有表达，在肌肉和脑中的表达量相对较高，且不存在显著差异，在其他组织中表达量相对较低（图 3A），这种表达情况可能与该基因参与生长分化、细胞骨架蛋白解聚和其他细胞功能相关。在副溶血弧菌感染下，PtRab2A 的表达量在 72 h 时发生显著差异，相对于对照组提高 2.28 倍（图 3B）。
2.3 副溶血弧菌感染后 PtRab2A DNA 甲基化分析
利用 IGV 可视化软件分析 PtRab2A 基因在副溶血弧菌感染后的甲基化图谱，对扩增序列进行 DNA 甲基化水平分析发现，攻毒后 DNA 甲基化水平呈下降趋势（图4A）。通过 QUMA 在线网站对单克隆测序结果进行分析，副溶血弧菌胁迫 72 h 后，PtRab2A 平均甲基化率为 40%，0 h 为 69%，PtRab2A 甲基化水平明显降低，与 IGV 可视化图趋势一致（图4B）。采用 Pearson 相关系数分析副溶血弧菌感染后血淋巴组织 PtRab2A 甲基化水平和基因表达之间的相关性发现，相关系数为–1.000，表明 PtRab2A 甲基化水平和基因表达水平呈显著负相关（P<0.05）（图4C）。
图1三疣梭子蟹 PtRab2A 序列特征及蛋白三维结构
Fig.1Sequence characteristics of PtRab2A and three-dimensional structure of its protein in P. trituberculatus
A：PtRab2A 的核苷酸和推导的氨基酸序列，阴影部分为 RAB 结构域，*代表终止密码子； B：SWISS-MODEL 程序预测的 PtRab2A 中 RAB 结构域的空间结构。
A: Nucleotide and deduced amino acid sequence of PtRab2A. Shaded area is the RAB structural domain, * represents the stop codon. B: Spatial structure of the RAB structural domain in PtRab2A predicted by the SWISS-MODEL program.
图2三疣梭子蟹 PtRab2A 氨基酸多序列比对、结构域及系统进化树分析
Fig.2Multiple sequence comparison of amino acids, structural domains and phylogenetic tree analysis of PtRab2A in P. trituberculatus
A：PtRab2A 与其他 Rab 蛋白的多序列比对。在序列中保持一致的氨基酸残基为红色阴影，相似的氨基酸为红色字体。箭头代表中央 6 股 β 片状结构，螺旋结构为 α 螺旋。B：通过 SMART 预测，在 PtRab2A 中仅存在一个 RAB 结构域。 C：PtRab2A 与其他无脊椎动物和脊椎动物 Rab 蛋白的无根系统发生树。利用 MEGA11 程序的邻接（NJ）算法构建，1 000 Bootstrap。
A: Multiple sequence comparison of PtRab2A with other Rab proteins. Amino acid residues that are consistent are shaded in red, and similar amino acids are in red font. The arrows represent the central six-stranded β sheet structure with an α helix helical structure. B: Only one RAB structural domain is present in PtRab2A as predicted by SMART. C: Unrooted phylogenetic tree of PtRab2A with other invertebrate and vertebrate Rab proteins. Constructed using the neighbor-joining (NJ) algorithm of the MEGA11 program. Bootstrap=1 000.
图3三疣梭子蟹 PtRab2A 的组织表达（A）及血淋巴响应副溶血弧菌的表达（B）
Fig.3Tissue expression of PtRab2A (A) and its expression in hemolymph (B) response to V. parahaemolyticus
H：血淋巴；G：鳃；E：眼柄；Tr：胸神经节；I：肠； He：心脏；M：肌肉；Br：脑；S：胃；Hp：肝胰腺。不同字母表示组间差异显著（P<0.05）。
H: Hemolymph; G: Gill; E: Eyestalk; Tr: Thoracic ganglia; I: Intestine; He: Heart; M: Muscle; Br: Brain; S: Stomach; Hp: Hepatopancreas. Different letters indicate significant differences between groups (P<0.05) .
2.4 PtRab2A 功能验证
RNAi 结果显示，注射干扰剂后 PtRab2A 的表达量在 12 h 时出现显著降低（P<0.05），在 24 h 时敲降率达到 80%（图5A）。干扰 24 h 后，对实验组和对照组分别注射副溶血弧菌，死亡率统计结果显示，实验组在感染后 2~3 h 死亡率开始上升，由 34.3%增加到 78.1%，增长 2.27 倍，感染 4 h 后全部死亡。相较于实验组个体，对照组的死亡率在 4~5 h 时才开始上升，由 15.0%增加到 62.5%，增长 4.17 倍，在 6 h 时全部死亡。结果表明，相同时间点下实验组死亡率比对照组显著升高，且死亡高峰期提前（图5B）。
3 讨论
Rab 蛋白是最大的单体 GTP 酶家族，负责协调运输的各个连续阶段，例如囊泡形成、囊泡和细胞器运动以及囊泡与靶膜的拴系（Zerial et al，2001）。在 PtRab2A 的 C 端发现了 2 个保守的半胱氨酸残基，研究发现这是一种关键的翻译后修饰，使 Rab 蛋白能够结合并靶向细胞膜（Zerial et al，2001），说明 PtRab2A 可以精确地将囊泡与受体膜栓系在一起进行融合。系统进化树表明，三疣梭子蟹 PtRab2A 和拟穴青蟹聚为一支，并在序列上具有高度相似性，进化树分析符合传统分类次序，说明该基因具有高度保守性。
三疣梭子蟹 PtRab2A 在所有组织中均有表达，这与日本对虾（Wu et al，2007）和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）（Huang et al，2015）中的结果一致，进一步说明 PtRab2A 的高度保守性。在甲壳动物中，获得性免疫的缺失使先天免疫在抵御外来物感染过程中发挥着关键作用，而血淋巴作为重要先天免疫系统组成部分（Xin et al，2024），主要通过细胞吞噬的方式抵御外源生物侵入（Kong et al，2023）。在副溶血弧菌感染三疣梭子蟹 12 h 和 72 h 时，PtRab2A 表达量显著上调，表明其可能参与了对细菌感染的免疫应答，在其他物种中也存在类似情况。Rab 蛋白的过表达可以提高日本对虾血淋巴对副溶血弧菌的吞噬作用（Zong et al，2008）；对 Rab 进行敲除后发现，感染黄头病毒的斑节对虾血淋巴中的黄头病毒水平和上清液中病毒释放的 mRNA 和蛋白质水平受到显著抑制（Kongprajug et al，2017）。对 PtRab2A 基因进行敲降后，在相同时间点，相较于对照组，实验组的死亡率显著升高，且死亡高峰期提前，进一步说明 PtRab2A 基因参与免疫应答。因此，PtRab2A 可能通过调节血淋巴吞噬作用参与细胞免疫。此外，PtRab2A 在肌肉中高度表达，表明其可能参与三疣梭子蟹肌肉细胞的膜内运输。
与鱼类表现出的全基因组均匀分布的甲基化模式不同（Granada et al，2018），三疣梭子蟹 DNA 甲基化呈现“马赛克”式的模式。三疣梭子蟹全基因组 CG 位点甲基化水平仅有 10.78%（Zhou et al，2024），但鱼类中甲基化水平在 30%以上（Xiu et al，2019; Yang et al，2023; Yao et al，2022）。有研究表明，在抗病过程中 DNA 甲基化通过调节免疫相关基因表达提高对致病菌的抵抗能力（Ma et al，2024; Yang et al，2021），本研究对三疣梭子蟹 PtRab2A 内含子区域进行 DNA 甲基化分析，显示副溶血弧菌感染后，PtRab2A 的甲基化水平下降，而表达水平上升，呈显著的负相关，这与感染呼肠弧病毒（GCRV）的草鱼（Ctenopharyngodon idella）RIG-I 基因（Shang et al，2016）甲基化与表达水平关系一致。而内含子作为基因中的非编码片段，参与基因的特异性表达及基因转录等多种生物学过程（张入峰等，2013）。以上结果表明，PtRab2A 内含子区域的 DNA 甲基化降低会促进 PtRab2A 的表达，进而参与免疫应答。
图4三疣梭子蟹 PtRab2A 不同攻毒时间的 DNA 甲基化谱
Fig.4DNA methylation profiles of PtRab2A in P. trituberculatus at different time points post V. parahaemolyticus infection
A：PtRab2A 副溶血弧菌感染后的 DNA 甲基化图谱，B0-1、B0-2、B0-3、B72-1、B72-2 和 B72-3 分别表示 0 h 和 72 h 的 3 个生物学重复，线的高度为甲基化水平（0~1.00），方框中表示差异甲基化区域。 B：BS PCR 验证，黑色圆点表示发生甲基化的 CG 位点，白色圆点表示未发生甲基化的 CG 位点。 C：PtRab2A 基因表达和 DNA 甲基化联合分析，黑色为甲基化水平，红色为基因表达。
A: DNA methylation profiles before and after infestation with V. parahaemolyticus PtRab2A, B0-1, B0-2, B0-3, B72-1, B72-2, and B72-3 denote three biological replicates at 0 h and 72 h, respectively, the height of the line is the methylation level (0~1.00) , and boxes indicate differentially methylated regions. B: BS PCR validation, black dots indicate methylated CG sites, and white dots indicate unmethylated CG sites. C: Combined analysis of PtRab2A gene expression and DNA methylation, methylation levels in black, gene expression in red.
综上所述，本研究对三疣梭子蟹 PtRab2A 进行序列分析及物种进化分析，通过对全组织表达、不同攻毒时间的基因表达模式及其甲基化模式分析，并利用基因敲降实验验证该基因 DNA 甲基化参与先天免疫应答。研究结果为深入解析 DNA 甲基化对三疣梭子蟹抗副溶血弧菌的分子机制奠定了基础。
图5PtRab2A 干扰验证
Fig.5PtRab2A interference verification
A：干扰后 PtRab2A 相对表达量；B：副溶血弧菌感染后三疣梭子蟹死亡率。 *和**代表存在显著差异（*: P<0.05; **: P<0.01）。
A: Relative expression of PtRab2A after interference; B: Mortality rate of P. trituberculatus after V. parahaemolyticus infection. * and ** represent significant difference (*: P<0.05; **: P<0.01) .
