摘要
促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)在鱼类配子发生早期阶段发挥重要的调控作用。通过同源克隆获得星康吉鳗(Conger myriaster) fshβ 基因的编码序列(CDS)，利用生物信息学软件分析该基因编码蛋白的结构与特征，采用原核表达系统对 FSH 蛋白进行可溶性表达。克隆获得 fshβ 的 CDS 区为 378 bp，编码 125 个氨基酸。对序列特征进行分析，fshβ 存在保守性较强的 GHB(由 19~122 位的 104 个氨基酸组成)结构域，相对分子质量为 13.19 kDa，理论等电点为 6.00，为亲水性蛋白。fshβ 的前 1~19 个氨基酸为信号肽，无跨膜区；存在 2 个 N-糖基化位点、3 个 O-糖基化位点和 14 个磷酸化位点，主要定位于细胞核。fshβ 的二级结构主要含有 α-螺旋(12.0%)、β-折叠(24.8%)、无规则卷曲(63.2%)；其三级结构与日本鳗鲡(Anguilla japonica)、美洲鳗鲡(A. rostrata)、欧洲鳗鲡 (A. anguilla)、花鳗鲡(A. marmorata)的 fshβ 的三级结构较为相似。多序列比对及系统发育树分析显示，星康吉鳗 fshβ 与日本鳗鲡、美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡、花鳗鲡具有较高的同源性，为 68.50%~70.08%。构建了重组表达载体 pET-28a-FSH，转化到 Rosetta (DE3)感受态细胞中，以 IPTG 作为诱导剂进行了诱导表达。经 SDS-PAGE 鉴定，发现 fshβ 重组蛋白主要在上清液中表达，分子量大小与预期一致。采用亲和层析纯化的方法获得了纯度较高的重组 fshβ 蛋白。经 Western Blot 检测显示，在约 26.0 kDa 处有特异性条带，表明 fshβ 重组蛋白成功表达。本研究成功克隆星康吉鳗 fshβ，并对其序列特征进行生物信息学分析；利用原核表达系统成功表达 fshβ 重组蛋白，对后续探究星康吉鳗 fshβ 的调控机制及功能奠定基础，同时对星康吉鳗人工繁育技术的发展提供了新思路。
关键词
Abstract
The Conger myriaster is commercially important in fisheries and aquaculture. The artificial culture of C. myriaster is presently conducted by catching wild fry. Recently, this resource has notably declined, highlighting an urgent need to develop seedling production for its aquaculture. C. myriaster gonads cannot mature naturally in artificial culture owing to insufficient synthesis of endogenous gonadotropins. However, their gonads can be induced to mature by injecting hormones in vivo. The follicle-stimulating hormone (FSH) gene is crucial in fish sexual development and reproduction, and its regulatory mechanisms have been extensively studied. In this study, the coding sequence (CDS) of fshβ was cloned by PCR techniques. Bioinformatical analysis revealed that the CDS of FSH comprises 378 bp, encoding 125 amino acids. By analyzing the physical and chemical properties of the protein, the fshβ protein has a molecular weight of 13.19 kDa. The aliphatic index was 71.04, and the theoretical pI was 6.00. An instability index value of 51.57 indicates a state of instability. The functional domain analysis showed that the fshβ protein has a highly conserved GHB functional domain (comprising 104 amino acids at 19–122). The hydrophilicity and hydrophobicity analysis revealed that the fshβ protein is a hydrophilic protein. The 6th and 7th amino acids (Ala) and 8th amino acid (Leu) exhibited the strongest hydrophobicity (2.178), whereas the 106th amino acid (Asn) exhibited the strongest hydrophilicity (–1.722). The leader peptide and transmembrane domain analyses of fshβ protein revealed that the 1–19 amino acids are signal peptides without any transmembrane domains. The analysis of protein glycosylation sites showed that the fshβ protein contains two N-glycosylation sites and three O-glycosylation sites. The analysis of protein phosphorylation sites demonstrated that the fshβ protein contains 14 potential phosphorylation sites. Specifically, seven serine (Ser) and seven tyrosine (Tyr) phosphorylation sites exist. Subcellular localization analysis revealed that the fshβ protein was mainly localized in the nucleus. The secondary structure of the fshβ protein mainly comprises an alpha helix (12.0%), extended strand (24.8%), and random coil (63.2%). The tertiary structure of C. myriaster fshβ protein was compared with that of Anguilla japonica, A. rostrata, A. Anguilla, A. marmorata and Homo sapiens. The C. myriaster fshβ protein tertiary structure was observed to be similar to that of A. Japanica, A. rostrata, A. Anguilla, A. marmorata. However, differences were observed with the tertiary structure of H. sapiens. Based on the sequence alignment and phylogenetic analysis, the C. myriaster fshβ exhibited a closer evolutionary relationship with A. japonica, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata. The fshβ amino acid sequence of C. myriaster compared with A. japonica, A. rostrata, A. anguilla, and A. marmorata revealed similarities of 70.08%, 70.08%, 70.08% and 68.50%, respectively. The fshβ of C. myriaster exhibits high homology with other eels but low homology with other bony fish and mammals, indicating that fshβ has evolutionary differences during evolution. This study presents the successful production of recombinant C. myriaster fshβ protein using the pET-28a(+) expression system. NdeⅠ and XhoⅠ cleavage sites were inserted at both ends of the primers, and then fshβ was amplified by PCR. Subsequently, the fragment was conjugated to the pEASY-T1 vector to obtain the recombined plasmids, named pEASY-T1-fshβ. The recombinant plasmid pEASY-T1-fshβ and the pET-28a(+) vector were double-digested using restriction endonuclease NdeⅠ/XhoⅠ. After double-digested, the fragment was ligated into the pET-28a(+) vector to obtain the recombined plasmids named pET-28a-fshβ. To investigate the biological activities and physiological significance of pET-28a-fshβ, we used the pET protein fusion and purification system to produce plasmids pET-28a-fshβ in Trans1-T1 competent cells. Recombinant plasmids pET-28a-fshβ were transferred into Rosetta (DE3) cells, which were cultured under different IPTG induction conditions (0.01, 0.1, 0.5, and 1 mmol/L) at a temperature of 16 ℃ for 16 h. fshβ was efficiently expressed at different IPTG concentrations and under the above induction conditions. Therefore, the following optimized parameters were used in subsequent experiments: IPTG concentration of 0.5 mmol/L, incubated at 16 ℃ for 16 h. The supernatant and precipitate were analyzed using SDS-PAGE following induction of expression. SDS-PAGE analysis showed an evident thickened band at 26.0 kDa. It was also present in the supernatant as a soluble protein. The protein was purified using a His-tagged nickel affinity chromatography column. Western blot analysis confirmed the presence of the purified protein, demonstrating that the recombinant protein was specifically recognized by antibodies. The molecular mass of the protein was approximately 26.0 kDa, which was consistent with the expected size. This result indicates that the fshβ recombinant protein was successfully expressed. The results of this study revealed the preparation of recombinant fshβ protein in the C. myriaster to provide a theoretical reference for the subsequent use of exogenous recombinant fshβ protein to induce sexual maturation in Parent fish.
鱼类繁殖受到脑–垂体–性腺（BPG）轴的调控；促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）是垂体中产生的一种促性腺激素，在调控性类固醇激素合成、性腺发育和配子发生过程中发挥关键作用（Lancerotto et al，2025）。在硬骨鱼中，促性腺激素的双重性最早是通过分离大马哈鱼（Oncorhynchus keta）中 GtHⅠ和 GtHⅡ（即促卵泡激素和促黄体生成素）发现的（Mohamed et al，2022），它们是异源二聚体，由一个相同的 α 亚基与一个决定激素功能特异性的 β 亚基以非共价方式结合而成（Li B Y et al，2024）。FSH 由垂体分泌，主要由促滤泡激素受体介导，并通过促进雌二醇、11-酮基睾酮的生成来调节性类固醇激素的合成、性腺发育、配子发生、成熟以及最终的释放（Shingo et al，2010; Uehara et al，2024）。在雌鱼卵巢滤泡发育和成熟的过程中，FSH 主要作用于卵母细胞的滤泡，产生雌二醇并调节卵巢的发育（Li Y R et al，2024）；同时 FSH 参与雄鱼的精子发生过程（Nguyen，2023）。雌性斑马鱼（Danio rerio）敲除 FSH 会使卵泡生长迟滞，并延迟青春期启动，然而敲除 FSH 对雄性斑马鱼无明显影响（Chu et al，2015; Xie et al，2017）；这说明 FSH 的分子机制仍需深入研究。FSH mRNA 在星康吉鳗（Conger myriaster）卵巢发育早期阶段表达量较高，在卵巢处于初级卵黄球阶段时表达量达到高峰，后随卵巢发育在次级卵黄球阶段表达水平显著降低，故认为 FSH 可能参与卵黄发生的启动（Kajimura et al，2001）。在澳洲鳗鲡（Anguilla australis）的卵巢发育过程中，垂体中 FSH mRNA 和蛋白表达水平均在卵黄发生前阶段达到峰值（Nguyen et al，2019）。
星康吉鳗属硬骨鱼纲（Osteichthyes）、鳗鲡目（Anguilliformes）、康吉鳗科（Congridae）、康吉鳗属（Conger），广泛分布于中国的渤海、黄海、东海以及日本北海道南部到冲绳岛北部海域和朝鲜半岛附近海域（Zhao et al，2024; 陈彦等，2024）。星康吉鳗在渔业和水产养殖业中具有重要的商业价值，是我国的重要经济鱼类（Mu et al，2021a）。随着国际市场对星康吉鳗的需求日益增加，星康吉鳗的捕捞压力也随之加大（Mu et al，2021b）。目前，我国主要通过捕捞星康吉鳗野生苗种的方式进行人工养殖（杨浩等，2024），但近年来其资源严重衰退，该物种急需发展用于水产养殖的苗种生产技术（史宝等，2023）。
人工养殖实践表明，鳗鲡目鱼类由于内源性促性腺激素合成不足导致其性腺无法自然成熟（Kamei et al，2003）。目前，日本鳗鲡（A. japonica）、欧洲鳗鲡（A. anguilla）等已通过注射重组 fshβ 对性腺进行人工催熟，获得了较好效果（Penaranda et al，2018; Suzuki et al，2020; Kazeto et al，2023），但尚无使用原核表达生产的重组 fshβ 诱导星康吉鳗性腺发育方面的报道。本研究通过对星康吉鳗的 fshβ 进行克隆得到 CDS 区，并通过生物信息学分析方法，进一步探究星康吉鳗 fshβ 的序列功能特征，采用原核表达方式获得重组 fshβ 蛋白，揭示星康吉鳗重组 fshβ 蛋白的特征，以期为后续利用自体重组 fshβ 蛋白诱导星康吉鳗亲鱼发育成熟提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 实验鱼
实验用星康吉鳗取自山东省海阳市黄海水产有限公司。从工厂化养殖条件下的星康吉鳗后备亲鳗群体中随机选择大小相近、体色正常、皮肤光滑的健康鱼，平均体长为（578.4±12.5）mm，平均体质量为（330.6±5.2）g。实验前置于室内循环水养殖系统的 3 000 L 养殖水槽中暂养驯化 2 周，每日早晚各投喂 1 次，24 h 持续充氧，养殖水温范围为 21.5~24.0℃，氨氮<0.45 mg/L，亚硝酸盐氮<0.06 mg/L，pH 维持在 7.8~8.2，盐度为 28~32，DO≥6.0 mg/L。采用 MS-222 麻醉，迅速解剖取其垂体组织保存于液氮中，后转入 −80℃超低温冰箱中保存，用于总 RNA 提取。
1.2 总 RNA 提取和 cDNA 第一链的合成
使用 RNAex Pro 试剂（艾科瑞，中国）提取星康吉鳗垂体组织中总 RNA，通过 1%琼脂糖凝胶（艾科瑞，中国）电泳与超微量分光光度计（NanoDrop 2000C）（Thermo，美国）测定 RNA 的纯度和浓度。按照 cDNA 合成试剂盒（艾科瑞，中国）说明书将 RNA 进行反转录合成第一链 cDNA，获得的 cDNA 模板保存至 –20℃备用。
1.3 fshβ cDNA 克隆
以星康吉鳗垂体组织 cDNA 为模板进行克隆。基于 NCBI 上已公布的星康吉鳗近缘物种的 fshβ 编码保守区序列，利用 Primer Premier 5.0 软件设计 fshβ 的特异性引物（表1）。按照 ApexHF HS DNA 聚合酶预混液-FS（ 含染料）（ 艾科瑞，中国）操作说明使用 Bio-Rad S1000 PCR 仪（伯乐，新加坡）对垂体 cDNA 模板进行 PCR 扩增，PCR 条件：94℃预变性 5 min； 98℃变性 10 s，60℃退火 15 s，72℃延伸 1 min 30 s， 35 个循环；72℃延伸 5 min。PCR 体系（25 μL）：12.5 μL 2×ApexHF FS PCR Master Mix，0.5 μL cDNA，0.5 μL 正反向引物，11 μL ddH2O。产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测和分离，用 DNA 凝胶回收试剂盒（艾科瑞，中国）回收并纯化目的 PCR 产物，将目的产物连接到 pEASY-T1 克隆载体（全式金，中国），然后转化到 Trans1-T1 感受态细胞（全式金，中国）中，涂布于含氨苄青霉素（天根，中国）抗性的 LB 平板上，37℃过夜培养，将阳性克隆送至生工生物（上海）工程股份有限公司测序。
表1PCR 扩增引物
Tab.1Primers used for PCR amplification
1.4 生物信息学分析
星康吉鳗 fshβ 序列片段的测序结果使用 DNAMAN 6.0 软件进行比对拼接，得到 fshβ 的 CDS 区序列并推导其编码的氨基酸序列；通过 NCBI 数据库进行功能结构域预测（https ://www .ncbi .nlm .nih .gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）；应用 ProtParam 进行理化性质分析（https ://web .expasy .org/protparam/）；利用 ProtScale 进行亲水性与疏水性分析（https://web. expasy.org/protscale/）；利用 DeepTMHMM 在线网站进行跨膜区预测（https ://dtu .biolib .com/DeepTMHMM/）； 运用 SignalP 6.0 Server 进行信号肽预测（https :// services .healthtech.dtu .dk/services/SignalP-6.0/）；运用 NetNGlyc1.0 分析 N-糖基化位点（https ://services. healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/）；使用 YinOYang1.2 分析 O-糖基化位点（https ://services . healthtech .dtu.dk/services/YinOYang-1.2/）；在 NetPhos3.1 网站分析磷酸化位点（https ://services .healthtech.dtu. dk/services/NetPhos-3.1/）；通过 PSORT Prediction 进行亚细胞定位分析（https ://www .genscript.com/psort.html）； 通过 Psipred 网站对蛋白质二级结构进行预测（http :// bioinf .cs.ucl.ac.uk/psipred/）；从 AlphaFold 蛋白结构数据库中检索蛋白质三级结构（https ://alphafold .ebi.ac. uk/）。通过 NCBI 数据库中的 BLAST 对 fshβ 进行同源性分析，获得其他物种的氨基酸序列。运用 MEGA 6.0 软件，以邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建不同物种 fshβ 系统发育进化树（自扩展值为 1 000）；运用在线网站 Clustal Omega（https ://www .ebi.ac.uk/jdispat cher/msa/clustalo）软件对星康吉鳗 fshβ 与其他物fshβ 进行比对分析。
1.5 重组表达载体的构建
根据星康吉鳗 fshβ 序列特点，参照 pET-28a（+）载体（天根，中国）的多克隆位点排列特点，选取 NdeⅠ和 XhoⅠ作为酶切位点，利用软件 Primer Premier 5.0 设计 1 对特异性引物（表1），以星康吉鳗垂体 cDNA 为模板进行 PCR 获得目的片段。PCR 扩增条件：94℃ 预变性 30 s；98℃变性 10 s，60℃退火 15 s，72℃ 延伸 1 min 30 s，35 个循环；最后 72℃延伸 5 min。将得到的目的片段连接至 pEASY-T1 克隆载体，转化到 Trans1-T1 感受态细胞，涂布于含氨苄和青霉素抗性的 LB 平板上，37℃过夜培养，挑取阳性克隆使用 LB 液体培养基在 37℃下培养 6 h。使用质粒 DNA 提取试剂盒（ 艾科瑞，中国）提取重组质粒 pEASY-T1-fshβ，质粒样品送至生工生物（上海）工程股份有限公司测序验证。
参考限制性内切酶 NdeⅠ和 XhoⅠ（TaKaRa，日本）说明书，将测序成功的 pEASY-T1-fshβ 与原核表达载体 pET-28a（+）置于 37℃金属浴中双酶切反应 3 h，双酶切产物通过上述方法进行回收纯化。用 T4 连接酶（TaKaRa，日本）在 16℃条件下将双酶切产物连接 3 h，然后转化到 BL21 感受态细胞（全式金，中国），涂布于含卡那霉素（全式金，中国）的 LB 平板 37℃过夜培养。挑取阳性克隆菌落使用 LB 液体培养基在 37℃下培养 6 h，经菌液 PCR 鉴定后通过质粒 DNA 提取试剂盒提取重组表达载体 pET-28a-fshβ，产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用 DNAMAN 软件比对分析测序结果，以确定 fshβ 正确插入载体。
1.6 重组蛋白的诱导表达、纯化及 Western Blot 验证
将验证正确的 pET-28a-fshβ 转化到表达菌株 Rosetta（DE3）感受态细胞（博迈德，中国）中，涂布于 LB 平板（含卡那霉素）上，37℃过夜培养，挑取阳性克隆使用 LB 液体培养基培养 4 h，后将菌液转到 4 个 100 mL 的 LB 培养基（含 100 μg/mL 卡那霉素）中扩大培养至 OD600 nm值约为 0.6，然后分别加入 IPTG，使终浓度为 0.01、0.1、0.5、1 mmol/L，并于 16℃、200 r/min 诱导表达 16 h。通过 8 000 r/min 离心 10 min 收集诱导后菌体，PBS 洗涤并重悬菌体，每组各留存 1 mL 进行后续检测。其他剩余重悬液用超声波细胞粉碎机（新芝，宁波）破碎菌体后，12 000 r/min 离心 10 min，分离上清液和沉淀，沉淀用适量的 PBS 进行重悬，取 20 μL 上清液和沉淀重悬液，分别加入 4 μL 的 5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸 5 min，后进行 SDS-PAGE（12%分离胶）电泳检测重组蛋白的表达情况。
使用 His 标签蛋白纯化试剂盒（碧云天，中国）对目的蛋白进行亲和层析柱纯化，通过超滤离心管（索莱宝，中国）浓缩，采用 SDS-PAGE 检测纯化效果。收集纯化后的 fshβ 重组蛋白，在 SDS-PAGE 电泳后利用 eBlot™ L1 蛋白快速湿转仪（金斯瑞，中国）转移至硝酸纤维素（PVDF）膜上，转印成功后，在封闭液中室温封闭 PVDF 膜 1 h 以去除非特异性吸附；用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；后加入 1∶2 000 稀释的鼠抗 6×His 单克隆抗体（HRP conjugated），4℃过夜孵育，后在室温下孵育 1 h；用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；用 ECL 化学发光试剂盒（索莱宝，中国）在暗盒内显色 1~2 min，后使用化学发光成像系统（VILBER，法国）拍照观察。
2 结果与分析
2.1 fshβ 的 CDS 区扩增
根据设计的引物对星康吉鳗 fshβ 的 CDS 区进行扩增，得到 fshβ 的 CDS 区序列长为 378 bp（GenBank 登录号: PP210935），共编码 125 个氨基酸，序列中存在 1 个 GHB（由 19~122 位的 104 个氨基酸组成）结构域（图1）。
图1星康吉鳗 fshβ 基因 CDS 序列及推导的氨基酸序列
Fig.1Coding sequence of C. myriaster fshβ gene and the deduced amino acid sequence
方框部分：起始密码子；双下划线：功能结构域 GHB；终止密码子用*表示。
Start codon is marked with frame. Functional domain GHB is marked with double underline. The termination codon is denoted by *.
2.2 fshβ 序列特征分析
对 fshβ 序列特征进行生物信息学分析，结果显示，fshβ 共编码 125 个氨基酸，其中，亮氨酸含量占比最高为 13 个，占总氨基酸量的 10.4%；半胱氨酸含量次之，为 12 个，占总氨基酸量的 9.6%；而异亮氨酸占比最少，仅为 1 个，占总氨基酸量的 0.8%。氨基酸编码蛋白分子式为 C566H882N156O177S15，共含有 1 796 个原子，该蛋白含有 8 个带负电荷的氨基酸（天冬氨酸+谷氨酸）和 6 个带正电荷的氨基酸（精氨酸 +赖氨酸）。相对分子质量为 13.19 kDa，脂肪族指数为 71.04，理论等电点为 6.00，蛋白不稳定系数为 51.57，表明该蛋白为不稳定性蛋白；fshβ 可能是一种亲水性蛋白（图2），其中第 6、7 位氨基酸（丙氨酸）、第 8 位氨基酸（亮氨酸）的疏水性最强，均为 2.178，第106 位氨基酸（天冬酰胺）亲水性最强，为–1.722。fshβ 无跨膜结构域（图3），前 1~19 个氨基酸为信号肽；包含 2 个 N-糖基化位点（图4）、3 个 O-糖基化位点（图5）、 7 个丝氨酸磷酸化位点和 7 个酪氨酸磷酸化位点（图6）。 fshβ 亚细胞定位于细胞核，可能性为 43.5%。fshβ 的二级结构含有 α-螺旋 15 个（12.0%）、延伸链 31 个（24.8%）、无规则卷曲 79 个（63.2%），无规则卷曲是其含量最丰富的结构原件。通过比较星康吉鳗和其他鳗鲡目鱼类以及人（Homo sapiens）的 fshβ 三级结构发现，星康吉鳗 fshβ 的三级结构与日本鳗鲡、美洲鳗鲡（A. rostrata）、欧洲鳗鲡、花鳗鲡（A. marmorata）均较为相似，与人的 fshβ 存在结构差异（图7）。
图2fshβ 的亲/疏水性预测
Fig.2Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of fshβ protein
图3fshβ 的跨膜结构域预测
Fig.3Prediction of transmembrane domain of fshβ protein
图4fshβ 的 N-糖基化位点预测
Fig.4Prediction of N-glycosylation site of fshβ protein
2.3 fshβ 氨基酸多序列比对及同源性分析
对星康吉鳗与日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡等 7 种不同鱼类 fshβ 的氨基酸序列进行多序列比对（图8），发现 GHB 家族的保守信号序列 CAG（46~48）、 YPVA（94~97）。对星康吉鳗与 14 个物种的 fshβ 氨基酸序列进行同源性分析，结果显示，星康吉鳗 fshβ 与日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、花鳗鲡的同源性较高，分别为 70.08%、70.08%、70.08%、68.50%，与非洲爪蟾（Xenopus laevis）同源性最低，为 32.59%（表2）。系统进化分析显示，星康吉鳗的 fshβ 与其他鳗鲡目鱼类的 fshβ 聚为一小支，再与其他硬骨鱼类聚为一大分支，最终与两栖类和哺乳类聚在一起（图9）。
图5fshβ 的 O-糖基化位点预测
Fig.5O-glycosylation site prediction of fshβ protein
图6fshβ 的磷酸化位点预测
Fig.6Phosphorylation site prediction of fshβ protein
2.4 重组表达载体 pET-28a-fshβ 的构建与鉴定
PCR 扩增得到的目的片段长度约为 394 bp（图10），与预期大小一致。将目的片段连接至质粒 pEASY-T1 后，对 pEASY-T1-fshβ 测序，结果显示序列完全正确。对 pEASY-T1-fshβ 与 pET-28a（+）进行双酶切后，电泳检测结果显示，酶切产物大小约为 383 bp 和 5 289 bp（图11）。酶切产物经连接得到 pET-28a-fshβ，转化到 Trans1-T1 感受态细胞中进行培养，菌液 PCR 检测得到与预期大小相符的特异条带（图12）。对 pET-28a-fshβ 进行测序，结果表明，重组表达载体 pET-28a-fshβ 已正确构建。
图7星康吉鳗和其他脊椎动物 fshβ 的三级预测结构
Fig.7The predicted 3D structures of fshβ protein in C. myriaster and other vertebrates
A. 星康吉鳗；B. 日本鳗鲡；C. 美洲鳗鲡；D. 欧洲鳗鲡；E. 花鳗鲡；F. 人。
A. C. myriaster; B. A. japonica; C. A. rostrata; D. A. anguilla; E. A. marmorata; F. H. Sapiens.
图8星康吉鳗 fshβ 氨基酸序列与其他物种 fshβ 氨基酸对比
Fig.8Amino acid alignment of fshβ from C. myriaster and other species
以相似性 50%为阈值，≥50%以蓝色标注，≥75%以紫色标注，100%以黑色标注。★：星康吉鳗保守的半胱氨酸残基；破折号表示为使所有比较序列之间的一致性程度最大化而创建的间隔。
Similarity is set at 50% as threshold, greater than or equal to 50% is highlighted blue, greater than or equal to 75% is in purple, and 100% is in black. ★: Conserved cysteine residues of C. myriaster; Dashes represent gaps created to maximize the degree of identity among all compared sequences.
2.5 fshβ 重组蛋白的诱导表达、纯化及 Western Blot 鉴定
使用 SDS-PAGE 对诱导表达情况进行分析，结果显示，在 25.0~33.0 kDa 之间出现明显的加粗条带，而空载体对照菌则未出现，大小约为 26.0 kDa，与预期大小一致。尽管添加了不同浓度的 IPTG 诱导表达，但蛋白的表达量并未出现明显差异，因此，本研究将fshβ 重组蛋白的 IPTG 诱导浓度定为 0.5 mmol/L。将含有 fshβ 重组蛋白的菌液进行超声破碎后分别收集上清液和沉淀，SDS-PAGE 结果显示，加粗条带主要出现在上清液中，且染色较深，说明 fshβ 重组蛋白主要在上清液中表达。采用亲和层析法纯化 fshβ 重组蛋白，SDS-PAGE 结果显示，除目的蛋白外，仍存在少量杂蛋白（图13）。经 Western Blot 实验鉴定后，所纯化的蛋白可被抗体特异性识别，并在 26.0 kDa 处有特异性条带，表明 fshβ 重组蛋白已成功表达（图14）。
表2fshβ 氨基酸序列的同源性比对
Tab.2Homology comparison of fshβ amino acid sequence
图9fshβ 氨基酸序列的系统进化树分析（枝上数字表示自展值）
Fig.9Phylogenetic tree based on fshβ amino acid sequences (Numbers on branches indicate bootstrap support values)
3 讨论
本研究从星康吉鳗垂体中克隆得到 378 bp 的 fshβ 基因 CDS 区序列，编码 125 个氨基酸，与欧洲鳗鲡、金钱鱼（Scatophagus argus）、尼罗尖吻鲈（Lates niloticus）等硬骨鱼的 fshβ 大小相似（Degani et al，2003; Zhang et al，2018; Omony et al，2022）。通过多序列比对发现，其与鳗鲡目鱼类中的欧洲鳗鲡、花鳗鲡、日本鳗鲡 fshβ 同源性达到 68.50%~70.08%，与其他目鱼类 fshβ 的同源性为 38.40%~41.60%，与哺乳动物同源性为 35.11%~37.40%。其中，星康吉鳗 fshβ 与其他鳗鲡目鱼类同源性较高，但与除鳗鲡目以外的其他硬骨鱼类同源性相对较低，且对比两栖类、哺乳类等同源性均较低，说明 fshβ 存在进化差异。系统进化分析结果表明，星康吉鳗 fshβ 与鳗鲡目鱼类 fshβ 聚为一小分支，再与其他硬骨鱼类聚为一大分支，与同属于鳗鲡目的物种亲缘关系最近，与哺乳类的亲缘关系较远，符合其传统的分类地位与进化关系。
图10fshβ 插入酶切位点后的片段扩增
Fig.10Fragment amplification of fshβ after insertion into restriction site
M：DL1 000 DNA marker；1：PCR 产物。
M: DL1 000 DNA marker; 1: PCR amplification products.
图11pEASY-T1-fshβ 与 pET-28a（+）载体的双酶切产物
Fig.11Double digestion product of pEASY-T1-fshβ and pET-28a (+) vector
1：pEASY-T1-fshβ 双酶切产物；2：pET-28a（+）载体双酶切产物；M：DL 5 000 DNA marker。
1: Double digestion product of recombinant plasmid pEASY-T1-fshβ; 2: Double digestion product of pET-28a (+) vector; M: DL 5 000 DNA marker.
图12pET-28a-fshβ 菌液 PCR 鉴定
Fig.12PCR identification of pET-28a-fshβ bacteria
1：样品 1；2：样品 2；3：样品 3；4：样品 4； 5：样品 5；M：DL2000 DNA marker
1: Sample1; 2: Sample2; 3: Sample3; 4: Sample4; 5: Sample5; M: DL2000 DNA marker.
图13fshβ 重组蛋白的表达和纯化的 SDS-PAGE 检测
Fig.13SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant fshβ
M：预染蛋白标记（11~180 kDa）；1：pET-28a（+）空载； 2~5：0.01、0.1、0.5 和 1 mmol/L IPTG 诱导；6：0.5 mmol/L IPTG 诱导后上清液；7：0.5 mmol/L IPTG 诱导后沉淀；8：纯化后重组蛋白。
M: Prestained protein ladder (11~180 kDa) ; 1: pET-28a (+) empty; 2–5: 0.01, 0.1, 0.5, 1 mmol/L IPTG-induced; 6: Supernatant of bacterial induction by 0.5 mmol/L IPTG; 7: Sediment of bacterial induction by 0.5 mmol/L IPTG; 8: Purification of target protein.
蛋白质的功能由蛋白质的结构决定，保守的半胱氨酸残基和 N-糖基化位点被认为可以参与蛋白折叠和特异性受体结合过程（Hearn et al，2000; 郭煜文等，2023）。在硬骨鱼 fshβ 氨基酸序列中 N-糖基化位点的数量有一定差异，本研究分析星康吉鳗 fshβ 氨基酸序列可能含有 2 个 N-糖基化位点，这与欧洲鳗鲡、花鳗鲡等鳗鲡目鱼类的 fshβ 具有相同数量的 N-糖基化位点（Levavi-Sivan et al，2009; Huang et al，2009）。但在半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、花鲈（Lateolabrax japonicas）、巨骨舌鱼（Arapaima gigas）中，fshβ 仅含有 1 个 N-糖基化位点（王珊珊等，2013; Chi et al，2015; Sevilhano et al，2017）；在边尾平鲉（Sebastes taczanowskii）的 fshβ 氨基酸序列中，未发现 N-糖基化位点（Yamaguchi et al，2021）。此外，星康吉鳗 fshβ 含有 12 个半胱氨酸残基，通过多序列比对发现，其半胱氨酸残基的数量与其他硬骨鱼相同；但其与日本鳗鲡、美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡、花鳗鲡的第 1 个半胱氨酸残基的位置有所差异，与其他硬骨鱼的前 2 个半胱氨酸残基位置不同，并与斑马鱼 4 个半胱氨酸残基位置有区别。这些研究表明，星康吉鳗的 fshβ 在物种进化过程中出现了进化差异。鱼类 fshβ 序列特征具有相对较高的多样性，半胱氨酸残基位置不同可能与 fshβ 在不同海水鱼类中所发挥的生理作用存在略微差异有关（Molés et al，2020）。fshβ 是介导生殖调控的重要分子，在下丘脑–垂体–性腺生殖轴中起到承上启下的关键作用，后续仍需对星康吉鳗 fshβ 在性腺发育各时期发挥的生理作用进行深入研究，以期明晰星康吉鳗的生殖内分泌调控轴的作用机制。
图14fshβ 重组蛋白 Western Blot 鉴定结果
Fig.14Results of fshβ recombinant protein identification by Western Blot
M：预染蛋白标记（11~180 kDa）；1：pET-28a（+）空载； 2：fshβ 重组蛋白。
1: Prestained protein ladder (11–180 kDa) ; 2: pET-28a (+) empty; 3: fshβ recombinant protein.
大肠杆菌（Escherichia coli）是重组蛋白较好的表达宿主，重组蛋白在大肠杆菌中过表达时，可被表达为可溶性或不溶性蛋白。可溶性蛋白质折叠整齐，可以发挥生物功能，而不溶性蛋白质则聚集成包涵体，易于纯化，但折叠不当会导致其没有生物活性，故可对诱导条件进行优化和采用新的技术来生产可溶性的蛋白（Kim et al，2015; Chen et al，2023）。红笛鲷（Lutjanus sanguineus）SR-BI 基因原核表达研究中发现，当诱导条件为 16℃时，可溶性蛋白有较高的表达量，随着温度的上升，其表达量逐渐降低，表明低温诱导为产生可溶性蛋白的关键条件（王一帆等，2021）。优化褐牙鲆（Paralichthys olivaceus） GH 基因原核表达诱导条件的结果表明，诱导过程中的前 16 h 内蛋白表达量呈上升趋势，超过 16 h 后蛋白表达量随时间的增加而下降；此外，较高 IPTG 浓度（1~10 mmol/L）下 GH 表达水平较低，在 0.05~1 mmol/L 浓度条件下的蛋白表达量均较高，且无显著差异；说明合适的诱导时间与 IPTG 浓度为提高蛋白表达水平的关键因素（Choi et al，2018）。这与青海湖裸鲤（Gymnocypris przewalskii）IL-8 基因原核表达的实验结果相似，该研究同样发现，可溶性重组蛋白表达量会随诱导时间的增加呈先增加后减少的趋势，但随 IPTG 浓度的增加 IL-8 表达量无明显改变（马德昭等，2020）。本研究对星康吉鳗 fshβ 重组蛋白原核表达的诱导条件进行多轮的优化组合后，最终通过设置 16℃、16 h、 0.5 mmol/L IPTG 的条件成功表达出可溶性的 fshβ 重组融合蛋白。后续将通过对重组蛋白的活性及功能进行验证，以期实现规模化量产并应用于星康吉鳗促熟培育。
新表达系统的开发、基因编辑技术和 DNA 重组技术的进步，实现了对不同鱼类体内的激素和生长因子的生产，弥补了需要解剖大量鱼类却只能获取少量有效蛋白质的缺陷（Mohammadzadeh et al，2022）。 pET-28a（+）载体表达的蛋白质由蛋白标签和目的蛋白连接在一起，称为融合蛋白，其蛋白标签为 His-tag 和 T7-tag，相对分子质量约为 10 kDa（李文桂等，2010; 张小米等，2023）。本研究首次通过 pET-28a（+）载体与星康吉鳗 fshβ 构建了重组表达载体 pET-28a-fshβ，因此，fshβ 重组融合蛋白中插入了约 10 kDa 的 His-tag 和 T7-tag 标签，故实际表达的蛋白相对分子质量可能大于预测值。另有研究表明，由于氨基酸糖基化程度的差异，可能使其表现出不同的分子量大小（杨洪等，2023）；此外，在通过 SDS-PAGE 测定时，SDS 与糖蛋白的部分碳水化合物没有结合，会导致 SDS–糖蛋白复合物的电荷质量比降低，从而使其在凝胶中的迁移率变慢，故用 SDS-PAGE 方法测定的蛋白相对分子质量偏高（朱雷等，2022）。对本研究所表达的星康吉鳗 fshβ 重组蛋白进行 Western Blot 检测，结果显示，在约 26.0 kDa 的位置有 1 条特异性结合条带，符合预期大小。综上所述，本研究构建了重组表达载体并通过原核表达系统成功表达星康吉鳗 fshβ 重组融合蛋白，相对分子质量与预测大小也相符合，为后续深入解析星康吉鳗 fshβ 蛋白功能以及繁殖调控作用奠定了基础。
4 结论
本研究鉴定了星康吉鳗 fshβ 基因，并对序列特征及同源性进行了分析。利用原核表达系统构建了重组表达载体 pET-28a-fshβ，并诱导表达了可溶性的 fshβ 重组蛋白，蛋白分子质量约为 26.0 kDa，与预期大小相符。经 Western Blot 检测结果显示，纯化后的 fshβ 重组蛋白可以被抗体特异性识别，表明已成功表达了 fshβ 重组蛋白。
