黄条leptin原核表达与重组蛋白活性分析
doi: 10.19663/j.issn2095-9869.20241011005
崔爱君 ， 徐永江 ， 姜燕 ， 李羽婷 ， 李影 ， 赵梓涵 ， 王滨
中国水产科学研究院黄海水产研究所/深蓝渔业工程联合实验室 山东 青岛 266071
基金项目: 国家自然科学基金(32072993；32072949)、山东省重点研发计划(2023TZXD050)和中国水产科学研究院基本科研业务费(2023TD51；2024XT0701)共同资助
Prokaryotic Expression and Recombinant Protein Activity Analysis of leptin in Seriola aureovittata
CUI Aijun ， XU Yongjiang ， JIANG Yan ， LI Yuting ， LI Ying ， ZHAO Zihan ， WANG Bin
Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Joint Laboratory for Deep Blue Fishery Engineering, Qingdao 266071 , China
摘要
根据黄条 (Seriola aureovittata) lepa 和 lepb 编码氨基酸序列合成成熟肽片段，利用原核表达载体 pQE30 构建了黄条 leptin 重组质粒 lepa/pQE30、lepb/pQE30，分别转化至大肠杆菌 (Escherichia coli) M15 中。在 37 ℃条件下 0.5 mmol/L IPTG 诱导 4 h 获得了 LepA 和 LepB 重组蛋白，主要以包涵体形式存在。重组蛋白 LepA 和 LepB 大小分别为 17.9 kDa 和 17.3 kDa，经 Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化后，经 Western blotting 验证，2 种重组蛋白均可被 6×His 抗体特异性识别，表明均具有免疫活性。腹腔注射测试显示，3 个浓度组(0.05、0.1 和 0.2 μg/kg) LepA、LepB 蛋白分别注射不同时间后(6、12 和 24 h)脑中 lepa、lepb 基因均上调或下调表达，表明本研究获得的黄条 LepA 和 LepB 重组蛋白具有生物活性。研究结果可为深入研究黄条 leptin 的生理功能及作用机制、生长调控专用产品提供技术支撑。
Abstract

Leptin, a 16 kDa protein hormone encoded by the obesity gene (ob), is secreted by adipose tissue and essential for regulating various physiological processes, such as fat metabolism, feeding, reproduction, and immunity. Seriola aureovittata, prized for its flavor and high nutritional content, often experiences excessive fat accumulation under artificial farming conditions because of spatial constraints in farming facilities and the provision of fresh fish as feed. This fat accumulation can adversely impact their growth and quality. A recombinant leptin protein for S. aureovittata was constructed using a prokaryotic expression vector to investigate the multiple physiological functions of leptin, and its biological activity was verified via intraperitoneal injection. This study provides technical support for further investigation of the physiological regulatory role of leptin in the growth and fat metabolism of S. aureovittata and for developing specialized products for growth and quality control.

Total RNA was isolated from the brain tissue of S. aureovittata, and the first strand of cDNA was synthesized. Mature peptide fragments were synthesized based on amino acid sequences encoded by lepa and lepb in S. aureovittata. Using the prokaryotic expression vector pQE30, recombinant plasmids lepa/pQE30 and lepb/pQE30 were constructed and transformed into Escherichia coli M15. Following induction with 0.5 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 h, the expressed proteins were validated for their expected sizes via western blot analysis, revealing clear bands at approximately 17.9 and 17.3 kDa. This confirmed that the recombinant proteins exhibited antigenic activity and were specifically recognized by 6×His antibodies. Further purification of the target proteins via a Ni²⁺-NTA affinity chromatography column yielded purified LepA and LepB recombinant proteins, with purity verified at >90% and endotoxin levels ≤ 1 EU/μg. Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of the purified proteins showed distinct bands at approximately 17.9 kDa and 17.3 kDa, aligning with the expected size of the recombinant proteins, thereby confirming the effective purification of the LepA and LepB fusion recombinant proteins. The concentrations of the purified LepA and LepB recombinant proteins were measured at 0.2 and 0.3 mg/mL, respectively, using a protein quantification kit.

In the intraperitoneal injection experiment, four groups were established: a control group (0.9% saline solution) and experimental groups with concentrations of 0.05, 0.1, and 0.2 μg/kg. Each group consisted of 18 fish reared in a 1 m³ water tank. Each fish received an intraperitoneal injection of recombinant leptin protein at a dose of 1 μL/g body weight. At 6, 12, and 24 h after the first injection, brain tissues from six randomly selected fish were used to detect biological activity. After injecting three concentration groups (0.05, 0.1, and 0.2 μg/kg) of LepA and LepB proteins at different time points (6, 12, and 24 h), the expression of lepa and lepb genes in the brain was either upregulated or downregulated, indicating that the recombinant proteins LepA and LepB possessed biological activity. These results provide technical support for further research into the physiological functions and regulatory mechanisms of leptin in the growth and development of S. aureovittata.

瘦素（leptin）是由脂肪组织产生和分泌、肥胖基因（ob）编码的分子量大小为 16 kDa 的蛋白质类激素，属于Ⅰ类 α 螺旋细胞因子（Huising et al，2006）。自 2005 年在红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）中被鉴定以来，已在斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、达氏鲟（Acipenser dabryanus）、乌鳢（Channa argus）、暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）等硬骨鱼类中被成功克隆（Zhang et al，2013; Xu et al，2018; Chen et al，2020; Wen et al，2020; 余云登等，2021）。瘦素主要通过与位于下丘脑的瘦素受体结合后，通过信号级联放大作用发挥效用（Xu et al，2022; Frühbeck et al，2006）。已有研究表明，瘦素在脂肪代谢、摄食、生殖、免疫等生理过程中起重要的调控作用（Mantzoros et al，2011; Wen et al，2020; Tsakoumis et al，2022; Mariano et al，2013）。
在脊椎动物中，发现 leptin 基因一般以两种不同的分子形式存在，不同脊椎动物 leptin 同源性和生理功能也存在差异，表明 leptin 结构与功能的特异性（Gorissen et al，2014; Wen et al，2020）。同其他脊椎动物一样，鱼类也存在两种类型的 leptin 等位基因形式，为深入探究其生理功能及种的差异性，不同学者通过在体外获得 leptin 重组蛋白的形式（张雅星等，2019; Xu et al，2022），并利用重组蛋白在体内和体外层面开展了深入研究，为全面认识其生物学功能提供了科学高效的技术手段。
黄条（Seriola aureovittata）是一种在全球海洋中上水层广泛分布的大型游泳性鱼类，在中国沿海均有分布（刘静等，2015）。黄条肉质鲜美、营养丰富，是料理、寿司等的高端食材。在人工养殖条件下，由于养殖设施活动空间有限、投喂冰鲜杂鱼饵料等原因，往往容易造成养殖鱼类肌肉、内脏等组织中脂肪含量沉积过多，对其生长、品质等造成较大影响。鉴于探究 leptin 的多重生理功能，本研究根据已获得的黄条 leptin 基因序列（李影，2021），利用原核表达载体构建了黄条 leptin 重组蛋白，实现 leptin 重组蛋白的体外高效表达，同时利用腹腔注射的方法验证 leptin 重组蛋白的生物活性，以期为深入探究 leptin 在黄条生长和脂肪代谢中的生理调控作用研究及生长品质调控专用产品研制提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 实验对象
实验用 1 龄黄条 3 尾，取自山东省海阳市黄海水产有限公司，养殖水温为（19.0±0.8）℃。全长为（45.0± 2.2）cm，体重为（820.0±90.2）g，120 mg/L 的 MS-222 麻醉后解剖，迅速采集脑组织置于液氮中速冻，后转移至−80℃冰箱中保存，用于总 RNA 提取。
重组蛋白腹腔注射实验用 4 月龄黄条 144 尾，体重为（106.5±2.4）g，全长为（22.8±1.8）cm。实验开始前暂养 1 周，水温（19.0±0.8）℃、盐度 30、溶解氧>6 mg/L。每天 08:00、16:00 各按照体重的 2%投喂配合饲料。
1.2 RNA 提取和 cDNA 第一链反转录
使用 RNAiso Plus（TaKaRa，大连）提取脑组织总 RNA，通过超微量分光光度计（NanoDrop 2000C）（Thermo，美国）测定 RNA 纯度和浓度，以 1%琼脂糖凝胶电泳检验 RNA 完整性。使用 PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa，大连）合成 cDNA 第一链，用于 leptin 基因成熟肽的扩增，操作步骤严格按照说明书进行。
1.3 重组质粒 lepa/pQE30 和 lepb/pQE30 的构建
按照黄条 lepa（GenBank 登录号: MZ490590）和 lepb（GenBank 登录号: MZ490591）编码氨基酸序列，以 BamHⅠ和 HindⅢ作为酶切位点设计引物，扩增目的基因。将目的基因与 pEASY-T1 simple（全式金，北京）载体连接，后导入感受态细胞 Transl-T1（全式金，北京）中，经 20 μL 的 IPTG（0.5 mmol/L）和 40 μL 的 X-gal（20 mg/mL）处理后，37℃、200 r/min 条件下摇床培养 12 h，挑选阳性单克隆菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。
使用质粒小提试剂盒（TaKaRa，大连）提取lepa/pEASY-T1 和 lepb/pEASY-T1 质粒，用限制性内切酶 BamHⅠ和 HindⅢ（TaKaRa，大连）将 pQE30 质粒和载有目的片段的 pEASY-T1 Simple 质粒双酶切，使用 T4 DNA 连接酶（TaKaRa，大连）将双酶切后的目的基因和 pQE30 质粒表达载体连接，将连接完成的重组质粒 lepa/pQE30 和 lepb/pQE30 转化至感受态克隆菌株 Top10（Sangon Biotech，上海），37℃、200 r/min 培养 12 h，经菌液 PCR 验证后并测序获得阳性克隆菌。使用 NanoDrop 2000C 检测重组质粒 lepa/pQE30、 lepb/pQE30 浓度，于 15%的甘油中在−80℃下长期保存。
1.4 重组蛋白诱导表达与 Western blotting 验证检测
将提取 lepa/pQE30 和 lepb/pQE30 重组质粒，导入 M15（Invitrogen，美国）大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞中，热激后接种于含氨苄的 LB 固体培养基 12 h 后，筛选阳性克隆菌，转至 LB 液体培养基继续培养。当测定 OD 值为 0.6 时，添加诱导剂 IPTG（0.2 mmol/L 和 1 mmol/L），继续培养，分别于 15℃ 条件下培养 16 h、37℃条件下培养 4 h，未添加诱导剂的为阴性对照。培养结束后，离心收集菌体（4℃、 4 000 r/min、10 min），用 PBS（pH 7.4）缓冲液洗涤。菌体中加入缓冲液 A（20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）重悬，使用超声破碎仪使其充分破碎，离心后的沉淀使用缓冲液 B（8 mol/L Urea，20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）进行重悬，分别对上清液和沉淀处理，制样。
在含对应抗生素的培养基中培养菌液，当 OD 值达到 0.6 时，添加 1 mmol/L 诱导剂 IPTG，37℃条件下过夜培养进行表达，离心收集细胞菌体沉淀和对照菌沉淀。经 SDS-PAGE 电泳后，利用半干电转印法将蛋白转移至 PVDF 膜上，用 5% BSA 封闭 1.5 h，以防抗体与膜产生非特异性结合，室温下一抗（兔抗 His 标签，生工生物，上海）和二抗（羊抗兔 HRP标记二抗，生工生物，上海）分别孵育 2 h，TMB 显色，数码相机拍照。
1.5 重组蛋白的分离和纯化
用 0.5 mmol/L 的 IPTG 在 37℃条件下过夜培养后，离心（4℃，12 000 r/min，20 min），加 PBS 缓冲液洗涤，用裂解缓冲液重悬菌体，反复冰浴，超声破碎（400 W）20 min，离心（4℃，12 000 r/min）取上清液。用 Ni2+-NTA 亲和层析柱（TaKaRa，大连）纯化蛋白，流速 5 mL/min，4℃置于透析液（1×PBS，20% 甘油，0.5 mmol/L DTT，pH 8.0）中过夜，对粗蛋白洗杂流出、洗脱流出分别处理，用聚乙二醇（PEG20000）浓缩， SDS-PAGE 电泳检测。用非干扰型蛋白定量试剂盒 SK3071（生工生物，上海）检测浓度，放至−80℃超低温保存。
1.6 重组蛋白生物活性检测
1.6.1 重组蛋白腹腔注射
针对每一种重组蛋白，设置对照组、0.05、0.1 和 0.2 μg/kg 四个实验组，采用腹腔注射的方式，每个实验组使用 18 尾鱼，养殖在 1 m3 水体中，实验周期 24 h，实验开始前 24 h 停止投喂，实验水温为（19.0±0.8）℃、盐度 30、溶解氧>6 mg/L。对照组注射 0.9%的生理盐水溶液，实验组每尾鱼分别按照 1 μL/g 腹腔注射重组 leptin 蛋白，在首次注射后 6、12 和 24 h 每组分别随机采集 6 尾鱼的脑组织置于液氮中速冻，后转移至−80℃冰箱中保存备用。
1.6.2 实时荧光定量 PCR检测分析
使用 RNAiso Plus（TaKaRa，大连）提取重组蛋白腹腔注射实验鱼脑组织总 RNA，检测 leptin mRNA 的表达水平变化。根据黄条 lepa 和 lepb 的 cDNA 序列分别设计定量引物，以 arp mRNA（GenBank 登录号: HQ449735）为内参，实时荧光定量 PCR 引物序列见表1。
表1实时荧光定量 PCR 引物序列
Tab.1Primers sequences used for quantitative real-time PCR
利用罗氏 LightCycler480Ⅱ实时荧光定量 PCR仪（Roch，瑞士），使用 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，大连）试剂盒，PCR 体系为 10 μL，包括 5 μL 2×SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ、0.4 μL 上下游引物（引物浓度均为 10 μmol/L）、1 μL 稀释的 cDNA 模板以及 3.2 μL 无菌水，每个样品 3 个平行，采用两步 PCR 法：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，共 40 个循环，反应结束后进行熔解曲线分析。所有目的和参考基因的标准曲线相关系数（r2 ）和扩增效率（E）：0.99<R2 <0.999， 0.9<E<1.1。利用 2–ΔΔCt 的方法计算目的基因的相对表达量，结果以平均值±标准误（Mean±SE）表示。
1.7 数据分析
采用 SPSS 28.0 软件（IBM）进行数据统计分析，对基因 mRNA 表达水平进行单因素方差分析（one-way ANOVA）后作 Duncan 多重比较，当 P<0.05 时认为差异显著。
2 结果
2.1 黄条 lepa/pQE30 和 lepb/pQE30 重组质粒的构建
将载体和目的基因双酶切连接后构建的重组质粒 lepa/pQE30 和 lepb/pQE30 如图1和图2所示。
2.2 重组蛋白的诱导表达
重组质粒经转化、诱导，大量培养并破碎后进行 SDS-PAGE 电泳验证（图3），在 37℃、0.5 mmol/L IPTG 诱导 4 h 条件下，获得分子量约 17 kDa 处的目标条带与预期蛋白大小基本一致。
2.3 重组蛋白的 Western blotting 验证
用 Western blotting 免疫印迹方法对 37℃下 0.5 mmol/L IPTG 诱导 4 h 后的 lepa 和 lepb 重组菌分别进行检测，结果显示，lepa 和 lepb 重组菌分别在 PVDF 膜上约 17.9 kDa 和 17.3 kDa 处出现单一清晰印迹（图4），与目的蛋白大小一致，说明重组表达蛋白具有抗原活性，并被 6×His 抗体特异性识别。
2.4 重组蛋白的分离纯化
在 37℃条件下，取 0.5 mmol/L IPTG 诱导 4 h 的 lepa 和 lepb 重组表达菌，经 Ni2+-NTA 亲和层析柱分离纯化目的蛋白后，得到纯化 LepA 和 LepB 重组蛋白（经验证纯度>90%、内毒素≤1 EU/μg），经 SDS-PAGE 电泳检测在相对分子质量约为 17.9 kDa 和 17.3 kDa 处有明显条带（图5），与预期重组蛋白大小相匹配，可初步确定 LepA 和 LepB 融合重组蛋白成功得到纯化，另外，纯化后的 LepA 和 LepB 重组蛋白经蛋白定量试剂盒检测后的浓度分别为 0.2 mg/mL 和 0.3 mg/mL。
图1黄条 lepa/pQE30 重组表达载体图谱
Fig.1Recombinant expression vector map of lepa/pQE30 of S. aureovittata
环内红色区域表示插入的基因片段，括号中的数字代表该启动子或酶切位点等点位片段在质粒载体上的起始碱基数。下同。
The red area inside the ring indicates the inserted gene fragment, and the number in parentheses represents the number of starting bases on the plasmid vector for this promoter or cleavage site. The same below.
2.5 重组蛋白的生物活性分析
经腹腔注射 3 个浓度 LepA 重组蛋白后发现， LepA 蛋白可促进脑中 lepa mRNA 的表达，注射后 24 h 3 个浓度组均显著上调脑中 lepa mRNA 的表达，且 0.2 μg/kg 浓度组的 lepa mRNA 表达水平最高（P<0.05）（图6a）；0.05 μg/kg 浓度组在注射后 6 h、12 h 显著下调脑中 lepb mRNA 的表达，而 0.2 μg/kg 浓度组显著上调了脑中 lepb mRNA 的表达（图6b）。
LepB 重组蛋白注射实验组发现，3 个浓度组 LepB 重组蛋白注射后 6 h、12 h 对脑中 lepa 基因的表达影响不显著（P≥0.05），24 h 对脑中 lepa 基因表达的影响呈先升高后降低的趋势，且 0.1 μg/kg 浓度组 lepa mRNA 的表达水平最高（P<0.05）（图7a）； 3 个浓度组注射后 6 h 均显著下调脑中 lepb mRNA 的表达，0.1 μg/kg 浓度组在注射后 12 h 显著上调脑中 lepb mRNA 的表达（P<0.05）（图7b）。
3 讨论
已有研究表明，leptin 在硬骨鱼类脂肪代谢、摄食、生殖、生长等方面具有重要的生理调控作用（Deck et al，2022; Wen et al，2020; Tsakoumis et al，2022）。本研究成功实现黄条 lepa 和 lepb 基因的体外原核重组表达，并纯化获得了具有生物活性的重组蛋白。选择带有 6×His 标签的 pQE30 质粒作为原核表达载体， His 标签是分离纯化蛋白的有效标签，可利用蛋白质表面的特性进行亲和纯化，同时不会影响目的蛋白的生物学功能及活性，使重组质粒的构建操作过程更加简便，准确性更高（赵向绒等，2016），pET 载体被认为是目前大肠杆菌表达重组蛋白的强大系统，其基础表达水平较低，利于实现目的蛋白的高效表达（李斌等，2016），pQE30 质粒可在实验中发挥高稳定性瞬时表达的作用，成功将目的蛋白与原核表达载体连接（贺石汉等，2003）。IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间是影响原核表达系统中目的蛋白表达量的重要因素，本研究中 37℃条件下 0.5 mmol/L IPTG 诱导 4 h 是最佳条件，成功获得高表达重组蛋白。
图2黄条 lepb/pQE30 重组表达载体图谱
Fig.2Recombinant expression vector map of lepb/pQE30 of S. aureovittata
重组蛋白的生物活性可以通过在体内注射或离体孵育的方法验证，如对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）注射 leptin 融合重组蛋白的研究表明，腹腔注射纯化后的融合重组瘦素蛋白对草鱼脑、垂体和肠道的瘦素受体基因及 JAK2-STAT3 信号通路相关基因的表达有上调作用，证明制备的重组蛋白具有生物活性（罗文婕等，2020）；本研究通过腹腔注射重组 leptin 蛋白验证其生物活性，结果显示，注射不同浓度的 LepA、LepB 重组蛋白在 6、12 和 24 h 后对 lepa、lepb mRNA 表现出不同程度的影响。其中 3 个浓度组 LepA 蛋白在注射 6 h、24 h 后显著上调脑中 lepa mRNA 的表达；表明 LepA 重组蛋白可诱导自身 lepa 基因的表达，对自身 lepb 基因既有上调表达也有下调表达； 虹鳟注射重组瘦素蛋白后摄食减少（Johnson et al，2000），草鱼注射外源性重组瘦素蛋白可促进自身瘦素 mRNA 的表达，抑制 NPY mRNA 的表达（Li et al，2010）。与本研究结果一致，表明黄条 LepA 重组蛋白具有生物活性，且重组瘦素蛋白注射后促进自身基因表达，可能对摄食、能量消耗等起到重要的调控作用，但具体的作用机制还有待进一步研究。LepB 重组蛋白注射 6 h、12 h 后对自身 lepa 基因的表达影响不显著，但注射 24 h 后在不同浓度组中表达水平变化显著，注射短时间后抑制自身 lepb mRNA 的表达。张雅星等（2019）通过半滑舌鳎下丘脑离体孵育实验发现，1 nmol/L、10 nmol/L LepA 重组蛋白能显著抑制下丘脑 lepa、lepb 和 gnrh3 mRNA 的表达水平，但 100 nmol/L LepA 重组蛋白可上调 lepb mRNA 表达。说明经不同浓度重组蛋白处理后对自身 leptin 基因的表达不一致，但均可表明 LepA、LepB 重组蛋白可有效调节黄条脑中 leptin 基因的表达，通过原核表达系统体外获得黄条 LepA 和 LepB 重组蛋白具有明显的生物活性。 leptin 在草鱼、乌鳢、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）、鲭鱼（Scomber Scombrus）中已被证明具有调节摄食、脂肪代谢、调控生殖等生物学功能（Li et al，2010; Wen et al，2020; Zhang et al，2015; Ohga et al，2020），在黄条中具体生物学功能还未见研究。本研究成功获得具有生物活性的 leptin 重组蛋白，可为今后探究 leptin 重组蛋白在黄条摄食、生殖、代谢等相关基因之间的调控机制提供基础，从而为深入探究 leptin 在黄条脂肪代谢中的生理调控作用及研制生长品质调控专用产品提供技术支撑。
图3黄条 lepa/pQE30（a）和 lepb/pQE30（b）重组表达产物的 SDS-PAGE 分析
Fig.3SDS-PAGE analysis of lepa/pQE30 (a) and lepb/pQE30 (b) fusion protein from S. aureovittata
M：蛋白 marker；1：0.5 mmol/L IPTG 诱导前总蛋白； 2 和 3：0.5 mmol/L IPTG 20℃诱导过夜后的上清液和沉淀； 4 和 5：0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导 4 h 后的上清液和沉淀。
M: Protein marker; 1: Total protein before induction with 0.5 mmol/L IPTG; 2 and 3: Supernatant and precipitate at 20℃ post overnight induction with 0.5 mmol/L IPTG, respectively; 4 and 5: Supernatant and precipitate at 37℃ post 4 h of induction with 0.5 mmol/L IPTG, respectively.
图4黄条 LepA（a）和 LepB（b）重组蛋白的 western blotting 验证
Fig.4Detection of recombinant LepA (a) and LepB (b) protein from S. aureovittata by western blotting
M：蛋白 marker；1：37℃下 0.5 mmol/L IPTG 诱导 4 h 的 LepA 和 LepB 重组表达蛋白。
M: Protein marker; 1: Recombinant LepA and LepB protein post 4 h induction at 37℃ with 0.5 mmol/L IPTG.
图5黄条 LepA（a）和 LepB（b）最终纯化蛋白 SDS-PAGE 分析
Fig.5SDS-PAGE of the final purified protein of LepA (a) and LepB (b) from S. aureovittata
M：蛋白 marker；S：融合目的蛋白。
M: Protein marker; S: Fusion protein.
图6LepA 重组蛋白对黄条脑中 lepa mRNA（a）和 lepb mRNA（b）表达的影响
Fig.6Effect of relative expression of LepA recombinant protein on lepa mRNA (a) and lepb mRNA (b) in brain of S. aureovittata
LepA50、LepA100 和 LepA200：注射的 LepA 重组蛋白浓度分别为 0.05、0.1 和 0.2 μg/kg。不同字母表示差异显著（P<0.05），下同。
LepA50, LepA100, and LepA200: Injection concentration of LepA recombinant protein is 0.05, 0.1, and 0.2 μg/kg, respectively. Different letters indicate significant difference (P<0.05) , and the same below.
图7LepB 重组蛋白对黄条脑中 lepa mRNA（a）和 lepb mRNA（b）表达的影响
Fig.7Relative expression of LepB recombinant protein on lepa mRNA (a) and lepb mRNA (b) in brain of S. aureovittata
LepB50、LepB100 和 LepB200：注射的 LepB 重组蛋白浓度分别为 0.05、0.1 和 0.2 μg/kg。
LepB50, LepB100, and LepB200: Injection concentration of LepB recombinant protein is 0.05, 0.1, and 0.2 μg/kg, respectively.
图1黄条 lepa/pQE30 重组表达载体图谱
Fig.1Recombinant expression vector map of lepa/pQE30 of S. aureovittata
图2黄条 lepb/pQE30 重组表达载体图谱
Fig.2Recombinant expression vector map of lepb/pQE30 of S. aureovittata
图3黄条 lepa/pQE30（a）和 lepb/pQE30（b）重组表达产物的 SDS-PAGE 分析
Fig.3SDS-PAGE analysis of lepa/pQE30 (a) and lepb/pQE30 (b) fusion protein from S. aureovittata
图4黄条 LepA（a）和 LepB（b）重组蛋白的 western blotting 验证
Fig.4Detection of recombinant LepA (a) and LepB (b) protein from S. aureovittata by western blotting
图5黄条 LepA（a）和 LepB（b）最终纯化蛋白 SDS-PAGE 分析
Fig.5SDS-PAGE of the final purified protein of LepA (a) and LepB (b) from S. aureovittata
图6LepA 重组蛋白对黄条脑中 lepa mRNA（a）和 lepb mRNA（b）表达的影响
Fig.6Effect of relative expression of LepA recombinant protein on lepa mRNA (a) and lepb mRNA (b) in brain of S. aureovittata
图7LepB 重组蛋白对黄条脑中 lepa mRNA（a）和 lepb mRNA（b）表达的影响
Fig.7Relative expression of LepB recombinant protein on lepa mRNA (a) and lepb mRNA (b) in brain of S. aureovittata
表1实时荧光定量 PCR 引物序列
Tab.1Primers sequences used for quantitative real-time PCR
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