摘要
本研究以肉食性的珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂)为研究对象，研究高糖饲料中添加二甲双胍对其生长性能、糖酵解酶活性和肠道菌群的影响。将 540 尾珍珠龙胆石斑鱼随机分成 6 组，每组 3 个重复，每个重复 30 尾鱼，均重为(10.4±0.01) g。以 2 种不同糖水平的正对照(20%，PC)和负对照(30%，T0)以及在负对照饲料的基础上分别添加 0.2% (T2)、0.4% (T4)、0.6% (T6)和 0.8% (T8)的二甲双胍作为实验饲料饲养 8 周。与对照组相比，高糖饲料显著提高了珍珠龙胆石斑鱼的肝体比(P<0.05)，而补充二甲双胍后，脏体比和肝体比显著降低(P<0.05)。饲喂高糖饲料使珍珠龙胆石斑血清中葡萄糖、低密度脂蛋白和甘油三酯含量升高，肝脏葡萄糖-6- 磷酸酶(G6Pase)和果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)活性增加(P<0.05)，在补充二甲双胍后，葡萄糖、低密度脂蛋白和甘油三酯含量下降，肝脏 G6Pase 和 FBPase 活性显著降低，并且葡萄糖激酶(GK)、 6-磷酸果糖激酶(PFK-1)和丙酮酸激酶(PK)活性显著增强(P<0.05)。高糖饲料增加了变形菌门 (Proteobacteria)、发光杆菌属(Photobacterium)的相对丰度(P>0.05)，在高糖饲料中补充二甲双胍后，肠道中厚壁菌门(Firmicutes)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)相对丰度增加，而发光菌属的相对丰度降低。在本实验条件下，当高糖饲料中补充 0.2%二甲双胍改变肠道微生物的组成，改善高碳水化合物饲料导致石斑鱼肠道菌群葡萄糖代谢紊乱，从而促进糖酵解和抑制糖异生，进而调节了血糖稳态，有利于提高珍珠龙胆石斑鱼对碳水化合物的利用率。
Abstract
Hybrid groupers have emerged as a significant aquaculture species owing to their high market value and growing demand. However, carbohydrate-rich diets pose a challenge for efficient glucose metabolism in this species. This phenomenon stems from the limited capacity of fish to effectively metabolize glucose in response to high-carbohydrate diets, resulting in persistent hyperglycemia that adversely affects growth performance. Impaired insulin sensitivity and dysfunction in insulin signaling, characterized by compromised insulin receptor function, blocked insulin cascades, and failure to activate critical signaling pathways, such as the PI3K/AKT pathway, have been identified as key factors contributing to this metabolic disorder. Therefore, this study investigated the application of metformin, a biguanide with recognized hypoglycemic properties, to ameliorate the adverse effects of high-carbohydrate diets in hybrid groupers (Epinephelus lanceolatus × E. fuscoguttatus). A total of 540 pearl gentian grouper, averaging (10.44±0.01) g, were selected and randomly distributed into six treatment groups, each consisting of three replicates with 30 fish per replicate. Six iso-nitrogenous and iso-lipid diets were formulated: A positive control (20% carbohydrate, PC), one negative control (30% carbohydrate, T0), and four experimental groups supplemented with metformin at concentrations of 0.2% (T2), 0.4% (T4), 0.6% (T6), and 0.8% (T8) relative to the negative control. The results show that the carbohydrate and metformin levels in the feed had no statistically significant effect (P>0.05) on the feed coefficient ratio (FCR) and survival rate (SR). Notably, a high-carbohydrate diet reduced growth performance (WGR, SGR) in hybrid groupers and altered serum biochemical parameters, increasing glucose, triglycerides, and LDL. Meanwhile, decreasing insulin and HDL. Metformin supplementation mitigated these effects, improving lipid metabolism markers and partially restoring HDL levels, with optimal outcomes at higher doses. Growth and organ indices demonstrated linear or quadratic trends in response to metformin, though condition factor (CF) and alpha diversity of gut microbiota were unaffected. Metformin also modulated gut microbial composition, decreasing Proteobacteria and Photobacterium while increasing Firmicutes and Brevibacillus.
In the present study, a high-carbohydrate diet inhibited growth performance, decreased insulin sensitivity, and increased the abundance of pathogenic intestinal bacteria in hybrid groupers. In the present study, the administration of a high-sugar diet augmented with 0.2% metformin altered the composition of intestinal microorganisms, thereby enhancing the disruption of glucose metabolism in the intestinal flora of groupers. This disruption is induced by a high-carbohydrate diet that promotes glycolysis and inhibits gluconeogenesis, thereby regulating glucose homeostasis. This, in turn, facilitates an improvement in the utilization rate of carbohydrates by the pearl gentian grouper.
Keywords
珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀× E. lanceolatu♂）（Liu et al，2024）是一种优质的肉食性海水鱼类，因其杂交优势显著，在养殖中表现出较高的经济价值和较快的生长速度，其肉质嫩滑、营养丰富，备受消费者喜爱。在我国沿海地区被视为集约化养殖条件下最具发展潜力的海水鱼类之一（Liu et al，2023）。
碳水化合物是鱼类所需的三大营养素之一，因其经济实惠且能有效地为鱼类提供能量，故被广泛应用于鱼类的饲养中，作为其主要的能量来源（Xia et al，2015）。然而，不同食性的鱼类对碳水化合物的利用效率存在差异。与杂食性和草食性鱼类相比，肉食性鱼类在碳水化合物利用效率上相对较差（Wang et al，2016; Li et al，2019）。研究表明，淡水石斑鱼（E. akaara）（Moro et al，2010）对碳水化合物的需求量为 7.40%。常能观察到摄食高碳水化合物饲料的肉食性鱼类餐后持续高血糖和生长性能受到抑制。通常认为，肉食性鱼类的碳水化合物需求量不超过 20%，长期过量摄入碳水化合物会对鱼类产生一系列负面影响，例如生长缓慢、脂肪肝以及蛋白质和脂质的表观消化系数较低（Chen et al，2012）。珍珠龙胆石斑鱼作为典型肉食性鱼类，对糖的利用能力较低（Li et al，2019），这与在欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）（Enes et al，2011）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）（Del Sol Novoa et al，2004）上的研究结果相一致。
二甲双胍（1，1-二甲基双胍盐酸盐），常温下为白色结晶性粉末，它的降糖机制与胰岛素分泌无直接关联（Bailey，1988）。实际上，二甲双胍主要通过促进胰岛外组织对葡萄糖的吸收和利用，以及影响糖原的合成和糖异生过程等多种途径来发挥其降糖功效（Hundal et al，2000; Polakof et al，2012）。在哺乳动物中，二甲双胍已被证明能够通过改善胰岛素结合增强胰岛素敏感性，从而加速外周组织的葡萄糖摄取，但其在鱼类中的糖耐受调控机制仍有待研究（Wilson et al，1994）。
鱼类肠道菌群在维护机体健康方面扮演着至关重要的角色，它不仅能够促进免疫系统的建立，还能够帮助形成防御屏障，抵御致病菌的入侵，同时还能提高营养物质的吸收和利用效率（Peng et al，2019）。在正常状态下，肠道内的微生物群落与宿主及外部环境保持着一种动态的平衡状态，此时肠道菌群的种类和数量相对稳定（Nayak，2010）。这些肠道微生物在宿主体内的定居和稳定对于宿主的健康至关重要，它们对宿主的营养代谢、免疫反应等方面有着重要的影响（Zhu et al，2016）。一旦肠道菌群失调后，肠内致病菌大量增殖，不同种类的致病菌将通过直接或间接的作用方式促进疾病的发生发展（Iacob et al，2019; Zeng et al，2016）。研究表明，高碳水化合物（30%）饲料会增加鱼类肠道有害微生物的相对丰度（Zheng et al，2023）。另外，有关研究表明，二甲双胍对大鼠（Rattus norvegicus）和小鼠（Mus musculus）肠道微生物群具有显著影响，能够通过改变肠道微生物群发挥部分降血糖作用，从而维持肠道屏障的完整性，促进短链脂肪酸（SCFA）的产生，调节胆汁酸代谢，并改善葡萄糖稳态。
综上所述，本研究旨在探究二甲双胍对珍珠龙胆石斑鱼生长性能及肠道菌群的影响，进而探讨其在配合饲料中的应用潜力，以提高该鱼种对碳水化合物利用率。
1 材料与方法
1.1 实验材料
饲养实验得到了广东海洋大学动物伦理委员会的批准。实验在广东湛江（863）项目海水养殖种子工程南方基地开展。实验所用的鱼苗从广东湛江鸿运鱼苗场购买。
以红鱼粉、酪蛋白和明胶为主要蛋白源，鱼油和大豆卵磷脂为主要脂肪源，制作 6 种等氮等脂的实验饲料（表1），其中包括正对照（20%碳水化合物，PC）和负对照（30%碳水化合物，T0）以及在负对照基础上添加质量分数为 0.2%、0.4%、0.6%和 0.8%的二甲双胍（ 购于广东科城实验室装备有限公司， BePure-33776XM-a，BePure 纯度为 99.9%），分别记为 PC、T0、T2、T4、T6 和 T8 组。将所有原料粉碎后过孔径为 80 目的筛网，按饲料配方称取各组分量原料，然后将原料混合物与大豆卵磷脂和鱼油充分混合后再通过孔径 60 目的筛网，经 V 型立式混合机充分混匀。最后，使用双螺杆挤条机（华南理工大学总厂，F-75）将混合物挤压成型。将成型的饲料在室温下风干 48 h，于‒20℃冰箱里保存。
1.2 实验方法
1.2.1 实验设计及养殖管理
取规格匀称、体质健康、平均体重为（10.4±0.01）g 的珍珠龙胆石斑鱼，随机分配到 18 个 0.5 m3 的桶中，每桶鱼 30 尾。共分成 6 个组，每个组 3 个重复。每天 08:00 和 17:00 对石斑鱼进行饱食投喂，并记录喂食量。实验养殖周期为 8 周。养殖溶解氧浓度≥5 mg/L，水温为（28±2）℃，盐度为 28~30，pH 值为 7.8~8.2。
1.2.2 样品采集
在样品采集前停饲 24 h。每桶鱼称取重量并记录。每桶取 5 尾鱼，抽血，静置于 4℃ 12 h，离心，收集上清液，用于测定血清生化指标。随机从每个养殖桶里取 2 尾鱼肠道，用于测定肠道菌群；另外，剖取肝脏，置于防爆管中并将样品存放于 –80℃超低温冰箱保存，用于测定组织酶活性指标。从每个桶中收集 3 条全鱼对鱼体营养成分进行分析。
表1实验饲料组成及营养水平（干物质基础，%）
Tab.1Formulation and nutrients levels of the experimental diets (dry matter, %)
注：1：红鱼粉：水分 8.39%、蛋白干重 74.48%、脂肪干重 7.20%；酪蛋白：水分 12.35%、蛋白干重 90.53%、脂肪干重 0.10%；明胶：水分 22.00%、蛋白干重 77.99%、脂肪干重 3.96%。2：预混料（多维多矿）由青岛玛斯特生物技术有限公司提供。3：诱食剂为甜菜碱从河南高宝实业有限公司购置，执行标准：Q/JYXY0008-2021。
Note: 1: Red fish meal: Moisture8.39%, crude protein 74.48% (dry weight) , crude fat 7.20% (dry weight) ; Casein: Moisture12.35%, crude protein 90.53% (dry weight) , crude fat 0.10% (dry weight) ; Gelatin: Moisture22.00%, crude protein 77.99% (dry weight) , crude fat 3.96% (dry weight) .2: Premix offered by Qingdao Master Biotech Co., Ltd.3: The feeding stimulant (betaine) was purchased from Henan Gaobao Industrial Co., Ltd., and its production complied with enterprise standard Q/JYXY0008-2021.
1.2.3 饲料常规与鱼体营养成分测定
日粮的常规营养成分按 AOAC 方法测定。水分含量采用 105℃ 下的干燥恒重法测定，粗蛋白含量由杜马斯定氮仪（荷兰，Skalar 公司）测定，粗脂肪含量由索氏抽提分析仪测定，粗灰分含量是通过在马弗炉中 550℃下灼烧法进行测定。
1.2.4 血清生化指标测定
使用全波长微孔板酶标仪和紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定血清生化指标。使用南京建成试剂盒测定血清葡萄糖（GLU，F006-1-1），胰岛素（INS，ml022831），甘油三酯（TG，A110-1-1），总胆固醇（TC，A111-1-1），高密度脂蛋白（HDL，A112-1-1）和低密度脂蛋白（LDL，A113-1-1）。
1.2.5 肝脏糖脂代谢相关酶活性的测定
将肝脏组织从–80℃的冰箱中取出后，准确称取 1~2 g，按质量与体积比 1∶9 的比例加入生理盐水，并在冰上解冻。然后，在冰水浴条件下用组织研磨机进行充分研磨匀浆，直到没有明显的块状沉淀。最后，将匀浆液在高速台式冷冻离心机（M1416R）中离心（4℃条件下，2 500 r/min 离心 10 min），取上清液进行检测。使用上海酶联试剂盒测定葡萄糖激酶（GK，ml037558），6-磷酸果糖激酶（PFK-1，ml076598），丙酮酸激酶（PK，ml092887），磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK，ml076994）、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase，ml095181）和果糖-1，6-二磷酸酶（FBPase，ml077027）。
1.2.6 肠道菌群测定
从每个网箱中选取 2 尾珍珠龙胆石斑鱼，取肠道样品进行基因组 DNA 提取，然后根据测序区域的选择，使用带有 Barcode 的特异性引物和高效性保真酶进行 PCR 扩增。引物序列为 27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）and 1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）。然后，回收和定量扩增产物，构建的文库在 Qubit 定量和文库测试后由 Thermo Fisher Life Ion S5™ XL 进行测序。肠道菌群的测序和数据分析委托广州基迪奥生物科技有限公司，其中使用 Usearch UPARSE 算法（97%相似度）聚类 Clean tags 生成 OTUs，经 UCHIME 去除嵌合体后统计 OTU 丰度，以最高丰度 tag 作为 OTU 代表序列。使用 Krona（version 2.6）展示分类丰度，R 语言绘制堆叠图，circos（version 0.69-3）软件生成丰度和弦图以及 pheatmap 制作热图；16S 数据中采用 PICRUSt2（version 2.5.3）预测 KEGG 通路，BugBase（version 1.0）分析表型以及 FUNGuild（version 1.1）推断真菌的功能组（guild）。
1.3 数据统计分析
本研究数据采用 SPSS Version 26.0 软件进行统计分析，并对数据进行正态性和方差同质性的检验。本研究中使用 2 种分析方法。使用 Dunnett 检验确定 PC 与其他各组之间的差异是否显著。其次对除 PC 外的实验组（T 组）进行单因素方差分析（one-way ANOVA），采取正交多项式对比法进行曲线拟合来确定效果是线性还是二次性。
2 结果
2.1 高糖饲料中添加二甲双胍对珍珠龙胆石斑鱼生长性能和形态指标的影响
如表2所示，与 PC 相比，不同添加水平处理组的饲料系数（FCR）、存活率（SR）均无显著性影响（P>0.05）。与 PC 相比，T0 组的末重（FBW）、增重率（WGR）和特定生长率（SGR）均显著下降（P<0.05），随着饲料中二甲双胍水平的增加，FBW、WGR 和 SGR 呈下降趋势，并在 T8 组达到极值，呈线性模型（P<0.05）。
如表3所示，与 PC 组相比，T0 组脏体比（VSI）指标显著上升（P<0.05），而肥满度（CF）和肝体比（HSI）的形态指标有所下降，但无显著影响（P>0.05）。随着饲料中二甲双胍水平的递增，VSI 和 HSI 均显著下降（P>0.05），并呈二次曲线模型，并均在 T8 组达到最小值，但对 CF 无显著影响（P>0.05）。
表2珍珠龙胆石斑鱼的生长性能和形态指标（平均值±标准差，n = 3）
Tab.2Growth performance and morphological index of hybrid grouper (Mean±SD, n = 3)
注：*表示 Dunnett 检验中实验组（T 组）和对照组（PC 组）之间的显著差异。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P <0.001； 无*表示该组与 PC 组之间没有显著差异。下同。
Notes: * means the significant difference between each test group (Group T) and control group (Group PC) by Dunnett's test. *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P <0.001; no * denotes no significant difference between this group and the Group PC. The same below.
生长性能使用以下公式计算：
增重率（WGR，%）=100×[最终体重（g）–初始体重（g）]/初始体重（g）；
特定生长率（SGR，%/d）=100×[ln（ 最终体重（g）–ln（初始体重（g）]/实验天数（d）；
饲料系数（FCR）=进料量（g）/[最终体重（g）–初始体重（g）]；
存活率（SR，%）=100×（最终鱼数/初始鱼数）；
肥满度（CF）=100×[体湿重（g）/体长（cm）3 ]；
肝体比（HSI，%）=100×[肝脏湿重（g）/体重（g）]；
脏体比（VSI，%）=100×[内脏湿重（g）/身体湿重（g）]。
2.2 高糖饲料中添加二甲双胍对珍珠龙胆石斑鱼体成分的影响
如表3所示，饲料中碳水化合物和二甲双胍水平对全鱼粗蛋白和灰分均无显著性影响（P>0.05）。高糖膳食显著降低了全鱼水分含量，随着饲料中二甲双胍水平的递增，水分含量在 T4 组达到最大值，并与 PC 组无显著性差异（P>0.05）。高糖膳食显著增加了全鱼粗脂肪含量，随着饲料中的二甲双胍水平的递增，粗脂肪含量呈现二次曲线模型，并在 T4 组达到最小值。
表3珍珠龙胆石斑鱼的体成分（平均值±标准差，n = 3）
Tab.3Body composition of hybrid grouper (Mean±SD, n = 3)
2.3 高糖饲料中添加二甲双胍对珍珠龙胆石斑鱼血清生化的影响
如图1所示，T0 组显著增加了珍珠龙胆石斑鱼 GLU、TG、LDL 含量和显著降低了 HDL、INS 含量（P<0.05）。总体上，随着二甲双胍添加水平的增加，石斑鱼血清 GLU、TG、LDL 含量呈下降趋势（P<0.05），分别在 T2 组、T8 组、T6 组达到最小值，并均呈现二次曲线模型；HDL 呈上升趋势（P<0.05），在 T08 组达到最大值并呈现线性模型。血清 TC 呈下降趋势，无显著差异（P>0.05）。
2.4 高糖饲料中添加二甲双胍对珍珠龙胆石斑鱼肝脏糖脂代谢酶的影响
如图2所示，高糖膳食对 GK、PFK-1 和 PK 活性并无显著影响（P>0.05）。随着饲料中二甲双胍含量的增加，肝脏 GK 和 PK 活性出现上升的趋势，分别在 T6 组和 T8 组达到最大值并呈现线性模型；而 PFK-1 活性在 T8 组达到最大值并呈现二次曲线模型。高糖膳食显著增加了 FBPase 和 G6Pase 活性（P<0.05），而对 PEPCK 活性无显著影响（P>0.05）。随着饲料中二甲双胍含量的增加，PEPCK 和 G6Pase 活性显著下降，二者均在 T8 组达到最小值，前者呈现二次曲线模型，后者呈现线性模型；而对 FBPase 活性无显著影响（P>0.05），且呈现二次曲线模型。
2.5 高糖饲料中添加不同水平二甲双胍对珍珠龙胆石斑鱼肠道菌群的影响
2.5.1 肠道菌群丰富度和 PCoA 分析
如图3a所示，根据 Venn 图分析，珍珠龙胆石斑鱼肠道核心 OTUs 占 216。其中，各组内共享的 OTU 比例分别 66.61%、 66.71%、66.87%、70.37%、71.50%和 71.23%。显然随着二甲双胍添加量的增加，T6 组独有的 OTUs 数最多（542），其次是 T8 组（535）和 T4 组（513）。基于 Weighted Unifrac 距离采用主坐标法（PCoA）进行分析（图3b）。结果表明，PC 组和 T6 组距离较近，说明肠道菌群结构相似。T0 组与其余组距离较远，说明肠道菌群结构存在差异性。T2、T4 及 T8 组距离较近，肠道菌群结构相似。
2.5.2 物种组成分析
如图4a所示，珍珠龙胆石斑鱼的前 10 个门水平肠道菌群从高到底分别为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes），其相对丰度较高，为优势菌门。其他门水平菌群为蓝藻菌门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、髌骨细菌门（Patescibacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）和变形菌门（Epsilonbacteraeota）。如图4b~d所示，饲喂高糖饲料增加了珍珠龙胆石斑鱼肠道变形菌门的相对丰度，而降低了厚壁菌门的相对丰度，随着饲料中二甲双胍水平的递增，厚壁菌门的相对丰度升高，而变形菌门的相对丰度下降。
图1珍珠龙胆石斑鱼血清生化指标（平均值±标准差，n = 3）
Fig.1The serum biochemical indicators of hybrid grouper (Mean±SD, n = 3)
*表示 Dunnett 检验中实验组（T 组）和对照组（PC 组）之间差异显著。*：P <0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。图表将中位数显示为一条线。下同。
* means significant difference between each test group (Group T) and control group (Group PC) by Dunnett's test. *: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001. The violin chart displays the median as a line. The same below.
图2珍珠龙胆石斑鱼肝脏糖酵解和糖异生酶活性
Fig.2Hepatic glycolytic and gluconeogenesis enzyme activity of hybrid grouper
如图5a所显示，在属水平菌群短芽孢杆菌属（Brevibacillus）是相对丰度最高的物种，其次是发光杆菌属（Photobacterium）、弧菌属（Vibrio）、不动杆菌属（Acinetobacter）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、sva0996_marine_group、芽孢杆菌属（Bacillus）、巨单胞菌属（Marinomonas）、假芽孢杆菌属（Fictibacillus）。如图5b~d所示，饲喂高糖饲料导致珍珠龙胆石斑鱼肠道的短芽孢杆菌属的相对丰度降低，发光杆菌属的相对丰度升高，随着饲料中二甲双胍水平的增加，发光杆菌属的相对丰度降低，短芽孢杆菌属的相对丰度升高。
图3珍珠龙胆石斑鱼肠道菌群的维恩图（a）和 PCoA 分析图（b）
Fig.3Venn diagrams (a) and PCoA analyses (b) of the intestinal flora of hybrid grouper
图4不同水平二甲双胍对珍珠龙胆石斑鱼门水平肠道菌群结构和组成的影响
Fig.4Effects of different levels of metformin on the structure and composition of intestinal microbiota community in hybrid grouper at the phylum level
a：珍珠龙胆石斑鱼门水平肠道菌群结构；b：变形菌门相对丰度；c：厚壁菌门相对丰度；d：拟杆菌门相对丰度。
a: Structural composition of the intestinal microbiota in hybrid grouper at the phylum level; b: Relative abundance of Proteobacteria; c: Relative abundance of Firmicutes; d: Relative abundance of Bacteroidetes.
2.5.3 功能预测
Welch's t-test 的结果显示，高糖饲料组（T0）与二甲双胍补充组（T2~T8）在微生物代谢功能通路的分布上未呈现显著差异（图6）。尽管 Welch's t-test 分析显示部分代谢通路（如碳水化合物代谢、氨基酸代谢）在组间存在数值波动，但这些变化均没有显著性差异（P>0.05）。但与 T0 组相比，T6 组折叠、分类和降解功能显著增强（P<0.05）。
3 讨论
碳水化合物作为三大能量物质之一，不仅提供能量，而且起到节省蛋白质的作用（Shiau et al，1992）。食性是影响鱼类肠道微生物多样性的主要因素之一（荣华等，2024）。其中，肉食性鱼类利用碳水化合物的能力差，这是由于肉食性鱼类消化酶的活性低且数量有限（Hemre et al，2015）。研究表明，肉食性鱼类碳水化合物摄入水平接近 30%时生长性能显著下降（Ren et al，2011）；但添加合适量的时候对肉食性鱼类会具有积极的作用（窦兵帅等，2014）。本研究结果表明，摄入 30%水平碳水化合物后降低了珍珠龙胆石斑鱼的增重率和特定生长率，与上述研究一致，并与团头鲂（Megalobrama amblycephala）（蒋阳阳等，2016）、大黄鱼（Pseudosciaena crocea）（Cheng et al，2013）和金鲳鱼（Trachinotus ovatus）（Zhou et al，2015）的研究结果相似。二甲双胍是一种用于治疗糖尿病的药物，已被证明可通过调节代谢途径有效提高葡萄糖利用率（Herman et al，2022）。本研究结果表明，随着饲料中二甲双胍含量的增加，末重、增重率和特定生长率均显著降低，但添加 0.2%二甲双胍对珍珠龙胆石斑鱼生长性能无显著影响。这说明补充二甲双胍后生长性能下降可能是因为二甲双胍能增加脂质氧化并且使异位脂质存储减少，从而使得生长性能下降（Malin et al，2014）。
图5不同水平二甲双胍对珍珠龙胆石斑鱼属水平肠道菌群结构和组成的影响
Fig.5Effects of different levels of metformin on the structure and composition of the intestinal microbiota community in hybrid grouper at the genus level
a：珍珠龙胆石斑鱼属水平肠道菌群结构图；b：短芽孢杆菌属相对丰度；c：发光杆菌属相对丰度；d：弧菌属相对丰度。
a: Structural composition of the intestinal microbiota in hybrid grouper at the genus level; b: Relative abundance of Brevibacillus; c: Relative abundance of Photobacterium; d: Relative abundance of Vibrio.
图6不同处理组肠道菌群 KEGG 功能通路的分布比较
Fig.6Comparison of the distribution of KEGG functional pathways in intestinal flora of different treatment groups
此外，高碳水化合物的摄入还会影响鱼类形态学指标（Wang et al，2016）。本研究结果表明，高糖饲料显著提高了珍珠龙胆石斑鱼肝体比，与团头鲂（Megalobrama amblycephala）（Li et al，2013）的研究结果相似，这可能是由于碳水化合物摄入过量，从而导致肝脏脂肪沉积。先前的研究结果表明，在高碳水化合物饲料中添加二甲双胍能够降低大口黑鲈（Micropterus salmoides）（Wang et al，2024）肝脏脂肪含量。本研究中，随着饲料中二甲双胍水平的递增，珍珠龙胆石斑鱼肝体比和脏体比显著下降，这表明二甲双胍可能对缓解高碳水化合物饲料引起的肝脏脂肪问题有积极的影响。
血液中甘油三酯和总胆固醇的浓度被视为量度其脂肪代谢状况的关键指标。当这些指标异常升高时，通常反映出鱼类肝脏内脂肪积累过多，这种状况有可能引发脂肪肝疾病及肝脏肥大等症状，而其含量过低则表明鱼类营养不良，生长状况受到影响。葡萄糖是大多数脊椎动物生物的主要能量来源，鱼类和哺乳动物保持着特定的血糖水平（Bartoňková et al，2016）。胰岛素在鱼类体内发挥着多重生理作用，它不仅调节血糖水平，还涉及食欲、生长、发育和中间代谢等多个方面（Caruso et al，2011）。在本研究中，珍珠龙胆石斑鱼在饲喂 30%碳水化合物饲料后，其血糖和甘油三酯水平升高，而胰岛素水平却下降。这一现象可能与鱼类体内对糖负荷的激素调节能力受损及反应延迟有关，这些因素是导致葡萄糖代谢率低的原因之一（Li et al，2018）。同时，过多的碳水化合物可能转化为脂质，从而引发甘油三酯浓度的上升。适量的碳水化合物饲料对鱼类的糖代谢过程是有益的，然而，碳水化合物饲料摄入过量可能会造成血脂水平的升高和血流压力增加，例如高血脂、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的变化（Polakof et al，2012）。低密度脂蛋白作为内源性胆固醇的转运体，将脂肪从肝脏输送到外部，而高密度脂蛋白则相反（He et al，2021）。在补充二甲双胍后，珍珠龙胆石斑鱼血糖、甘油三酯、胆固醇、胰岛素水平降低，脂蛋白水平升高。这种变化可能是因为二甲双胍可以通过提高胰岛素结合来改善胰岛素敏感性，从而促进葡萄糖摄取，进而降低了血糖水平（Dominguez et al，1996; Kumar et al，2002）。实际上，随着血糖水平的下降，胰高血糖素和生长抑素受到的刺激减少，导致胰岛素分泌量相应减少（Harmon et al，1991）。
二甲双胍可以通过促进糖酵解和抑制糖异生，加快外周胰岛素靶组织中的葡萄糖处置，这可以有效地改善高血糖的状况，通常被视为一种正面的生理响应（Polakof et al，2012）。肝脏作为胰岛素的主要靶器官，在维持葡萄糖平衡中扮演着重要的角色，它通过调控葡萄糖的糖酵解、储存以及糖原的分解和糖异生过程来保持葡萄糖的平衡（Radziuk et al，2001）。与葡萄糖水平和糖原一样，葡萄糖感应机制也表现为葡萄糖代谢酶的变化，如 GK、PK、FBPase 和 G6Pase 活性（Marty et al，2007; Qian et al，2021）。本研究中，高糖饲料会增加糖异生的酶活性，然而，当高糖饲料中补充二甲双胍后，糖酵解相关的酶活性得到了促进，而糖异生相关的酶活性则受到了抑制。这一结果表明，肉食性鱼类在摄入高糖饲料后，可能会出现持续的高血糖症状，并且其血糖主要来源于内源性葡萄糖的产生。本研究的结果与一些食肉鱼类中的研究结果相似，这些鱼类通常在葡萄糖负荷后表现出糖异生酶活性的增加（Furuichi et al，1981; Jin et al，2014）。而二甲双胍可以改善胰岛素抵抗，增强胰岛素对肝脏葡萄糖产生的抑制作用，并促进肝外组织中胰岛素刺激下的葡萄糖利用（Stumvoll et al，1995）。
肠道菌群及其代谢产物与肠道健康密切相关，肠道健康在宿主的营养吸收、代谢、生理功能和免疫反应中发挥着关键作用（Fujimura et al，2010; Peng et al，2019）。变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是珍珠龙胆石斑鱼肠道中含量最高的微生物群（Ye et al，2020）。本研究结果发现，石斑鱼在摄食高碳水化合物后，肠道中变形菌门的相对丰度增加，而厚壁菌门的相对丰度降低。Textor 等（1997）研究表明，由于甲基柠檬酸循环将碳水化合物转化为丙酮酸盐，导致在高糖膳食下变形菌门相对丰度的增加。另外，Moon 等（2018） 研究表明，变形菌门涉及到许多有机酸和碳水化合物代谢的基因，并且包含了许多肠胃病原体。肠道的厚壁菌门和拟杆菌门发酵膳食纤维会产生丁酸、丙酸和乙酸这些短链脂肪酸（SCFA），它们通过作用于肠内分泌细胞表达的 G 蛋白偶联受体（GPCR）以多种方式影响宿主代谢。说明高糖膳食会增加珍珠龙胆石斑鱼肠道感染的疾病机率。本研究中，补充二甲双胍后厚壁菌门相对丰度增加，而变性菌门的相对丰度减少。某些固缩菌在解聚膳食纤维方面非常有效（Briggs et al，2021; Wu et al，2018）。这些细菌可以分解各种类型的膳食纤维，并产生促进健康的代谢物，如丁酸盐或乳酸盐（Ndeh et al，2018）。此外，丁酸盐和丙酸盐已被证明能激活肠道葡萄糖生成，带来新陈代谢方面的益处，如降低脂肪积累、改善葡萄糖控制和减少肝脏葡萄糖生成（De Vadder et al，2014）。有研究表明，短芽孢杆菌在体外和体内都具有抑制病原体的能力（Mahdhi et al，2012; Yang et al，2023）。发光杆菌属被认为是多种水生动物，例如鱼类、甲壳类和软体动物的条件性致病菌，其过度增殖可通过分泌溶血素破坏肠道上皮屏障（Terceti et al，2016）。从属水平上看，补充二甲双胍后发光杆菌属的相对丰度降低而短芽孢杆菌的相对丰度增加。研究表明，芽孢杆菌通常利用多种营养物质进行生长，同时释放相关的消化酶和其他必需的生长因子来促进宿主营养物质的吸收，从而预防肠道疾病并改善生长和存活，产生对人体健康有益的代谢产物，如丁酸或乳酸（Nimrat et al，2012）。此外，丁酸盐与丙酸盐一起被证明可以激活肠道糖异生，从而在能量稳态中产生代谢益处，如减轻肥胖和降低体重，以及更好地控制葡萄糖，包括减少肝脏葡萄糖生成（De Vadder et al，2014）。短链脂肪酸（SCFA），如乳酸、丁酸和丙酸，通过葡萄糖的糖酵解和氨基酸、有机物的代谢产生，是肠上皮细胞的重要燃料，并通过激活 AMPK 加强肠屏障以保持肠道完整性（Elhaseen et al，2013）。这表明高碳水化合物饲料会增加珍珠龙胆石斑鱼肠道健康风险，而添加二甲双胍能提高肠道有益菌相对丰度，促进有益代谢物的产生。
4 结论
珍珠龙胆石斑在摄食高糖饲料后，其生长受到了抑制，同时，血清中葡萄糖、甘油三酯和总胆固醇水平升高，此外还导致肝脏糖异生酶活性增强，并降低了胰岛素的敏感性，进而导致肠道变形杆菌、发光杆菌等肠道致病菌相对丰富增加。以增重率、血清生化指标、糖代谢酶活性以及肠道菌群为判断依据，在高糖饲料中补充 0.20%二甲双胍能够提高肠道中厚壁菌门和短芽孢杆菌等有益菌丰度，促进糖酵解，抑制糖异生，进而调节血糖，有利于提高石斑鱼对碳水化合物的利用率。
