摘要
本研究旨在探讨大菱鲆(Scophthalmus maximus)长期在不同养殖环境下的消化代谢昼夜节律，实验设置高温组(23 ℃、盐度 30)、低盐组(16 ℃、盐度 10)和对照组(16 ℃、盐度 30)，每日投喂 2 次(06:00 和 18:00)，养殖周期为 30 d。实验结束后，对大菱鲆幼鱼进行 72 h 的周期性采样，系统分析在不同养殖环境下大菱鲆幼鱼的体重增长情况以及几项关键消化酶(胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)和血清代谢物(皮质醇、葡萄糖、胆固醇和甘油三酯)的变化规律。结果显示，高温组的平均体重显著低于对照组和低盐组(P<0.05)，而低盐组和对照组之间的体重差异则不显著。胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的节律性在各组均未达到显著性水平，但对照组和低盐组的消化酶活性在前 48 h 内呈现规律波动，而高温组则缺乏明显规律性，导致峰值提前或出现剧烈变化。皮质醇分析显示，对照组 72 h 和 48 h 的节律显著(P<0.05)，而低盐组和高温组的节律性均未达到显著性水平，高温组皮质醇含量在多个测量点显著高于其他 2 组(P<0.05)，低盐组皮质醇含量与对照组相比无显著差异。葡萄糖浓度在各组均未表现出显著的节律性，但对照组和低盐组在前 48 h 内葡萄糖含量呈现明显的周期性变化，而高温组的波动不规律。甘油三酯和胆固醇的分析显示，对照组和低盐组在 48 h 内具有显著的节律性(P<0.05)，而高温组未显示出显著的节律性；低盐组甘油三酯含量在多数测量点略低于对照组，高温组甘油三酯和胆固醇含量在多数测量点均显著高于对照组(P<0.05)。研究结果表明，相比低盐环境，高温对大菱鲆幼鱼的代谢和消化功能影响更大，表现为显著的应激反应和消化酶活性异常；血清皮质醇和甘油三酯的含量能够有效反映大菱鲆在不同环境胁迫条件下的健康状态和应激反应程度，还可以进一步用于抗逆性状选育评估。本研究揭示了大菱鲆在不同养殖环境下消化代谢节律的动态变化，为理解环境胁迫对鱼类代谢调控机制提供了新视角，研究结果不仅有助于提高大菱鲆的健康管理水平，还为其抗逆育种提供了潜在指标和实践参考。
Abstract
Circadian rhythms are a prevalent physiological phenomenon in organisms, referring to the adaptation and regulation of the internal clock to a 24-h cycle. This biological clock governs various physiological processes, such as the sleep-wake cycle, hormone secretion, and metabolic rate, enabling organisms to synchronize with external environmental changes between day and night. Although circadian rhythms have been thoroughly researched in terrestrial animals, their importance in aquatic animals has gradually gained attention in recent years. Fish and other aquatic animals rely on circadian rhythms to regulate their daily physiological and behavioral activities, such as feeding, swimming, and reproduction. The stability of circadian rhythms is essential for fish health. If the rhythm is imbalanced, the physiological activities of fish are disrupted, potentially leading to decreased digestive and absorptive capacity, weakened immune responses, and increased infection risk. Therefore, maintaining stable circadian rhythms indicates healthy aquaculture practices that promote overall fish health and aquaculture efficiency. The stable operation of circadian rhythms is influenced by various environmental factors, including light, temperature, salinity, dissolved oxygen, and density. These factors not only influence the formation of circadian rhythms but can also alter the metabolism and behavior of fish by disrupting physiological homeostasis. Despite environmental stress causing temporary imbalances in circadian rhythms, fish generally possess the capacity to readjust their physiological rhythms through adaptive changes and establish a new steady state suited to the new environment, thereby allowing their physiological rhythms to resynchronize with the external cycle and potentially approximate the rhythmic state of standard aquaculture environments. This phenomenon can be considered an expression of adaptability in fish. Therefore, stress resistance can be effectively assessed by monitoring changes in the stability of circadian rhythms in groups or families, thereby establishing a scientific basis for the genetic selection of stress-resistant traits in aquaculture. Circadian rhythms encompass various aspects, such as digestive and metabolic, immune, and endocrine rhythms. Among these, digestive and metabolic rhythms, fundamental to life activities, are particularly important for fish and other aquatic animals because they directly affect the efficiency of energy utilization by the body and subsequently influence the growth rate and health status. Digestive and metabolic rhythms are primarily monitored by detecting a series of key physiological and biochemical indicators, including digestive enzyme activity, glucose levels, cortisol concentrations, and triglyceride and cholesterol contents. These indicators can reflect the digestive function and stress status of fish at various time points. Despite applying these biochemical indicators in the health assessment of farmed fish, research remains limited regarding the impact of various aquaculture environments on the circadian rhythms of digestion and metabolism. Furthermore, there is even less investigation into how these rhythms are altered by different environmental pressures and their correlation with the stress resistance of fish, which requires further study. In this study, we aimed to investigate the circadian rhythm of digestive metabolism in turbot (Scophthalmus maximus) juveniles under various culture conditions. The experiment had three experimental groups, each representing distinct aquaculture environments: high-temperature group (23 °C, salinity 30), control group (16 °C, salinity 30), and low-salinity group (16 °C, salinity 10). The water temperature was controlled using a chiller, and salinity was regulated by adjusting seawater and freshwater flow rates. The light cycle was regulated by an automatic timer, with a light period occurring from 6:00 to 20:00 and a dark period occurring from 20:00 to 6:00 the next day. Feeding was conducted daily at 6:00 and 18:00, with each feeding session amounting to 1% of the body weight of the fish. Residual feed and feces were expeditiously cleaned to maintain water quality. The experiment lasted 30 days. After the experiment was concluded, sampling was performed every 4 h for 72 h (at 08:00, 12:00, 16:00, 20:00, 24:00, and 04:00) to analyze the weight gain of juvenile turbot in different aquaculture environments and changes in key digestive enzymes (trypsin, lipase, and amylase) and serum metabolites (cortisol, glucose, cholesterol, and triglycerides). The results showed that the average weight of the high-temperature group was significantly lower than that of the control and low-salinity groups (P < 0.05), whereas no significant difference was observed between the low-salinity and control groups. The rhythmicity of trypsin, lipase, and amylase did not reach significant levels in any of the groups. However, the digestive enzyme activity in the control and low-salinity groups demonstrated regular fluctuations during the first 48 h, whereas the high-temperature group lacked clear regularity, resulting in earlier peaks and more drastic variations. The cortisol analysis indicated that the 72-h and 48-h rhythms in the control group were significant (P < 0.05), whereas the low-salinity and high-temperature groups did not show significant rhythmicity. Cortisol levels in the high-temperature group were significantly higher than those in the other two groups at multiple measurement points (P < 0.05), whereas no significant difference was detected in cortisol levels between the low-salinity and control groups. Glucose concentrations did not show significant rhythmicity in any group. However, the control and low-salinity groups demonstrated marked periodic changes in glucose levels during the first 48 h, whereas the high-temperature group showed irregular fluctuations. The analysis of triglyceride and cholesterol levels revealed significant rhythmicity in both the control and low-salinity groups over 48 h (P < 0.05), whereas the high-temperature group did not show significant rhythmicity. The triglyceride levels in the low-salinity group were slightly lower than those in the control group at most measurement points, whereas the triglyceride and cholesterol levels in the high-temperature group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). Our findings indicate that high temperature has a greater impact on the metabolism and digestive functions of juvenile turbot than low salinity, manifesting as significant stress responses and abnormal digestive enzyme activities. Serum cortisol and triglyceride levels can accurately reflect the health status and stress response of turbot under different environmental stress conditions and may serve as indicators for evaluating resilience breeding. This study elucidates the dynamic changes in the digestive metabolic rhythms of turbot across different aquaculture environments, providing novel insights into the metabolic regulation mechanisms affected by environmental stress. The results not only enhance the health management of turbot but also provide potential indicators and practical references for resilience breeding.
昼夜节律是一种普遍存在于生物体中的生理现象，指生物体的内在时钟对 24 h 周期的适应和调节。该生物钟通过调节各种生理过程，如睡眠–觉醒周期、激素分泌、代谢速率等，帮助生物体同步于外部环境中的昼夜变化（邢陈等，2017）。昼夜节律不仅存在于高等动物中，如哺乳动物和鸟类，也广泛分布在无脊椎动物、植物，甚至单细胞生物中（Shi et al，2013; de Jong et al，2016; Chen et al，2014; Xie et al，2014; Mittag et al，2003）。昼夜节律在陆生动物中的研究较为深入，近年来，昼夜节律在水产动物中的重要性也逐渐受到关注。鱼类等水产动物同样依赖于昼夜节律来调节日常的生理和行为活动，如摄食、游泳和繁殖等（de Oliveira Guilherme et al，2023; Blanco-Vives et al，2009）。
昼夜节律的稳定运行受多种环境因素的影响，包括光照、温度、盐度、溶氧和密度等（Tian et al，2019; Espirito Santo et al，2020; Martins et al，2022; 王彦欣等，2023; Hernández-Pérez et al，2019）。这些因素不仅影响昼夜节律的形成，还可以通过干扰生理稳态而改变鱼类的代谢和行为。当鱼体面临新的环境压力时，其昼夜节律稳态往往会发生变化，导致短期的生理紊乱（Baekelandt et al，2019），但鱼类通常能够通过适应性变化重新调整其生理节律，形成与新环境相适应的新稳态（Ma et al，2025; Wang et al，2022）。因此，通过检测群体或家系的昼夜节律稳态变化，可以有效评估其抗应激能力，从而为水产养殖中抗逆性状的遗传选育提供科学依据。然而，关于不同养殖环境对昼夜节律影响的研究较少，且大多集中于短期环境因子变化的探讨，或在长期养殖体系中研究光照、投喂策略等非胁迫因素对昼夜节律的作用（Solovyev et al，2022; Baekelandt et al，2019），针对长期环境胁迫下昼夜节律适应性的研究仍较为稀缺。消化代谢节律作为生命活动的基础，在鱼类等水产动物中尤为重要，它直接影响机体的能量利用效率，从而影响生长速度和健康状况（Mata-Sotres et al，2016; Lopes et al，2023）。消化代谢节律主要通过检测一系列关键的生理和生化指标来监控，包括消化酶活性、葡萄糖水平、皮质醇浓度以及甘油三酯和胆固醇含量等。这些指标能够反映鱼类在不同时间点的消化功能和应激状态（Laiz-Carrión et al，2003; Li et al，2019; Espirito Santo et al，2020; Montoya et al，2010）。因此，通过检测这些指标的节律变化，可以评估鱼类对环境压力的适应能力，为水产养殖中的健康管理和抗逆选育提供重要参考。然而，尽管这些生化指标在养殖鱼类健康评估中已有应用，但关于不同养殖环境对消化代谢昼夜节律影响的研究仍然相对较少，尤其是探讨不同环境压力下昼夜节律如何变化及其与鱼类抗逆能力的关系，仍需深入研究。
大菱鲆（Scophthalmus maximus），作为我国重要的海水养殖鱼类，其高经济价值和广泛的养殖应用使得它成为研究昼夜节律的理想对象。大菱鲆以其快速生长、饲料转化率高和较强的环境适应能力而闻名，特别是在不同的温度和盐度环境下表现出优异的生长能力（Imsland et al，2001; Burel et al，1996）。但近年来大菱鲆养殖存在病害频发、抗逆力差、品质下降、养殖规模停滞不前等问题，亟需选育抗病、抗逆新品种，提高良种覆盖率，其中，耐高温和耐低盐选育对于南北接力养殖以及滩涂推广养殖具有重要意义。大菱鲆的昼夜节律调节，不仅影响其生长和消化代谢，还可能在面对环境压力（如水温波动、盐度变化）时，反映出其适应性和抗逆性。然而，现有的研究少有涉及消化代谢节律以及不同环境条件下的节律适应机制。本研究以大菱鲆幼鱼为研究对象，探索其在不同养殖环境下的消化代谢昼夜节律变化。通过监测消化酶活性、葡萄糖、皮质醇、甘油三酯和胆固醇含量等生化指标的昼夜动态变化，旨在揭示环境变化对大菱鲆消化代谢节律的影响，为科学评估鱼类的环境适应能力提供依据，为大菱鲆的健康养殖和抗逆性状选育提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 实验鱼及养殖管理
实验用鱼来自山东省威海广裕瀚海洋生物科技有限公司，选取 100 尾雌鱼和 60 尾雄鱼进行人工授精， F1 代达 5 月龄后，随机挑选 900 尾摄食活跃、体表无损伤的大菱鲆幼鱼，运至中国水产科学研究院黄岛琅琊基地进行养殖管理，平均体质量为（24.81±3.58）g，体长为（9.25±0.56）cm。将实验鱼养殖于直径为 1.2 m、高度为 1.5 m、容量为 1.6 m3 的圆柱形白色塑料桶中（9 个桶，每桶 100 尾）暂养 2 周，水温 16℃，盐度 30，溶解氧>7 mg/L，暂养第 2 周开始投喂配合饲料，每天投喂 2 次。
1.2 实验设计与取样
设置 3 个实验组，具体涉及到 3 个不同的养殖条件，包括高温组（23℃、盐度 30）、低盐组（16℃、盐度 10）和对照组（16℃、盐度 30）。温度和盐度设计依据生产和选育实践，其中高温 23℃，是普通大菱鲆进行正常投喂养殖的极限温度，若长时间超过此温度会造成大量的死亡；低盐度 10 是一个正常养殖的极限盐度，低于此盐度会造成较大的胁迫反应。暂养结束后，高温组以每天升温 1℃，连续 7 d 升至 23℃；低盐组每天降低 3，连续 7 d 降至 10；水温由冷水机控制，盐度通过调节海、淡水的流量进行控制。光照周期由自动定时开关控制，每天 06:00 至 20:00 为光照期，20:00 至次日 06:00 为黑暗期。每天分别在 06:00 和 18:00 投喂配合饲料，饱食投喂，及时清理残饵粪便，保持水质清洁，养殖周期为 30 d。之后在 72 h 内每 4 h 取样一次（08:00、12:00、16:00、 20:00、24:00、04:00）。每组随机选取 6 尾大菱鲆，使用 200 mg/L 的 MS-222 进行麻醉，快速测量体重、体长和全长。采集 0.5 mL 尾静脉血液，并立即转移至 1.5 mL 离心管中。采血后迅速解剖，采集肠组织，液氮速冻后转移至–80℃保存。采集的血液样本 4℃ 静置 6~8 h 后，4℃、3 000 r/min 离心 10 min，分离血清后转入–80℃保存，用于进一步分析。
1.3 血清代谢物与皮质醇含量测定
血清代谢物包括葡萄糖、甘油三酯和胆固醇。代谢物和皮质醇含量采用南京建成生物工程研究所的商业试剂盒使用微板法测定，甘油三酯和胆固醇在酶标仪 500 nm 波长下测定吸光度（OD 值），葡萄糖在酶标仪 505 nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中葡萄糖、甘油三酯和胆固醇含量，所有操作均按照试剂盒说明书进行。
1.4 消化酶活性测定
消化酶活性指标包括胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶。所有消化酶活性测定均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒使用比色法测定。肠道组织分析前于 4℃ 冰箱内解冻，在冰盘剪碎并迅速准确称取约 0.1 g 组织，随后加入 9 倍体积的匀浆介质，在冰水浴条件下机械匀浆，制成 10%匀浆液，4℃条件下以 2 500 r/min 离心 10 min，取上清液测定消化酶活性，所有操作均按照说明书操作流程进行。
1.5 数据处理与分析
增重率（weight gain rate，WG）和特定增长率（specific growth rate，SGR）计算公式如下：
式中，W0 和 Wt 分别为实验开始和结束时的体重（g）， t 为实验总天数（d）。
实验数据使用 Excel 2016 整理，所有数据以平均值±标准差（Mean±SD）表示。使用 SPSS 18.0 进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并通过 LSD 和 Duncan 多重比较检验分析生长数据的差异。对于消化代谢指标的比较，采用独立样本 t 检验，显著性水平均设置为 P<0.05。利用在线工具（Cosine）进行余弦分析，确定各指标的显著节律性。余弦分析基于最小二乘法的时间序列模型，评估波动的统计显著性，显著性水平设定为 P<0.05。
2 结果
2.1 不同养殖环境下大菱鲆幼鱼生长情况分析
实验结束后，统计 3 种养殖条件下大菱鲆幼鱼的生长情况，结果如表1所示。高温组的平均体重最小，显著低于对照组和低盐组，低盐组和对照组体重之间无显著差异；增重率和特定生长率的结果和平均体重结果一致。从生长数据来看，低盐环境未产生胁迫效应，而高温环境则导致了明显的生长胁迫。
2.2 不同养殖环境下大菱鲆幼鱼血清消化酶昼夜节律分析
胰蛋白酶浓度的余弦节律分析结果见表2和图1，各组节律均未达到显著性水平（P>0.05）。对照组的胰蛋白酶活性在前 48 h 内表现出相对规律的波动，波峰出现在 08:00 和 20:00，波谷出现在 12:00 和 00:00，第 3 天的变化不再规律。低盐组的胰蛋白酶活性变化与对照组相似，但在多数测量点略高于对照组。而高温组的胰蛋白酶活性变化趋势与其他 2 组明显不同，缺乏明显的规律性，且部分时间点与其他 2 组结果相反（如第 1 天的 08:00、20:00 以及第 2 天的 20:00 均处于波谷）。
表1不同养殖环境下大菱鲆幼鱼体长、体重情况
Tab.1Effect of different aquaculture environments on body length and body weight of juvenile turbot
注：不同字母表示不同组之间差异显著（P<0.05），无字母或字母相同表示差异不显著（P>0.05）。
Note: Different letters indicate significant difference in different groups (P<0.05) , no letter or the same letter indicate no significant difference (P>0.05) .
表2大菱鲆消化代谢指标的昼夜节律余弦分析
Tab.2Circadian cosine analysis of digestive and metabolic indicators in turbot
注：*表示在不同养殖环境下，72 h 或 48 h 内差异显著（P<0.05），无*表示差异不显著（P>0.05）。
Note: * indicates significant difference (P<0.05) in 72 h or 48 h under different aquaculture environment, and no * indicates no significant difference (P>0.05) .
图1不同养殖环境下大菱鲆肠道胰蛋白酶活性水平的余弦分析和昼夜节律
Fig.1Cosine analysis and circadian rhythm of intestinal trypsin activity in turbot under different aquaculture environment
a：低盐组 48 h；b：对照组 48 h；c：高温组 48 h；d：低盐组 72 h；e：对照组 72 h；f：高温组 72 h。灰色条代表夜晚，不加灰色条代表白天，*表示在该时间点不同实验组间差异显著（P<0.05）。下同。
a: Low salinity group 48 h; b: Control group 48 h; c: High temperature group 48 h; d: Low salinity group 72 h; e: Control group 72 h; f: High temperature group 72 h. The gray bar represents night, without the gray bar represents day, and * indicates significant differences between different experimental groups at that time point (P<0.05) . The same below.
脂肪酶浓度的余弦节律分析如表2和图2所示，各组均未表现出显著的节律性（P>0.05）。对照组和低盐组的脂肪酶活性在前 48 h 内表现出较为一致的波动规律，波峰出现在 08:00 和 20:00，波谷出现在 12:00 和 00:00，但第 3 天的变化不再规律。高温组的脂肪酶活性总体趋势与其他 2 组相似，但波峰时间提前至 16:00，且平均活性高于对照组，表明高温可能加速了脂肪代谢的活跃程度。
淀粉酶浓度的余弦节律分析见表2和图3。对照组和低盐组的节律均不显著（P>0.05），而高温组的 48 h 节律显著（P<0.05）。对照组和低盐组在前 48 h 内淀粉酶活性表现出较为一致的波动规律，波峰分别出现在 08:00 和 20:00，第 3 天的变化不再规律。与之相比，高温组的淀粉酶活性波动程度较大，且波峰时间提前至 16:00，显示出高温条件下淀粉酶活性更加剧烈的变化。
2.3 不同养殖环境下大菱鲆幼鱼血清代谢物与皮质醇昼夜节律分析
皮质醇浓度的余弦节律分析结果见表2和图4。在对照组中，72 h 节律和 48 h 节律均显著（P<0.05），而低盐组和高温组的节律性均未达到显著性水平（P>0.05）。
如图4所示，对照组血清皮质醇含量在 72 h 内保持相对稳定，第 3 天出现轻微波动；低盐组的变化趋势与对照组类似，且各测量点与对照组相比无显著差异。而高温组的皮质醇浓度在 72 h 内明显高于对照组，且在多个时间点显著升高（P<0.05），表明高温条件对大菱鲆幼鱼的应激反应具有显著影响。
葡萄糖浓度的余弦节律分析如表2和图5所示，所有实验组均未表现出显著的余弦节律（P>0.05）。对照组在前 48 h 内葡萄糖含量呈现明显的周期性变化，波峰出现在08:00和20:00，波谷出现在00:00和12:00。低盐组的变化趋势与对照组类似，且 2 组各测量点之间无显著差异。然而，高温组的葡萄糖变化未呈现明显的规律性，波峰波谷的出现时间与其他 2 组不一致，说明高温对葡萄糖代谢的调控可能存在较大扰动。
图2不同养殖环境下大菱鲆肠道脂肪酶活性水平的余弦分析和昼夜节律
Fig.2Cosine analysis and circadian rhythm of intestinal lipase activity in turbot under different aquaculture environment
a：低盐组 48 h；b：对照组 48 h；c：高温组 48 h；d：低盐组 72 h；e：对照组 72 h；f：高温组 72 h。
a: Low salinity group 48 h; b: Control group 48 h; c: High temperature group 48 h; d: Low salinity group 72 h; e: Control group 72 h; f: High temperature group 72 h.
甘油三酯浓度的余弦节律分析见表2和图6。对照组和低盐组的 48 h 节律显著（P<0.05），但 72 h 节律不显著；高温组未显示出显著的节律性（P>0.05）。对照组和低盐组在前 48 h 内，甘油三酯的变化呈一定的周期性，波动不明显，仅有明显的波峰出现在 08:00，第 3 天未出现明显的规律性和波动性，低盐组大多测量点略低于对照组。相比之下，高温组的甘油三酯浓度在前 48 h 内波动幅度更大，且波峰出现在 12:00，波谷出现在 20:00，多数时间点甘油三酯水平高于对照组，表明高温对脂类代谢有显著影响。
胆固醇浓度的余弦节律分析如表2和图7所示，对照组和低盐组的 72 h 和 48 h 节律均显著（P<0.05），而高温组未显示出显著的节律性。图7显示，对照组和低盐组的胆固醇浓度在 72 h 内表现出稳定的周期性变化，夜间浓度低于白天，波峰出现在 12:00，波谷出现在 00:00。高温组未表现出明显的规律性，波峰和波谷的出现时间不一致，且其胆固醇浓度在多数测量点显著高于对照组，表明高温对脂类代谢有显著影响。
3 讨论
尽管目前关于逆境条件下的节律研究相对较为有限，但生理节律的变化能够为个体应对和适应逆境提供关键信息。在多个不同环境下的比较转录组分析中，昼夜节律相关通路常常被显著富集，进一步证明了其在调控逆境响应中的关键作用（Cui et al，2020; Liu et al，2022）。作为生物体生命活动的基础，消化代谢对能量获取和维持正常生理功能至关重要（Wanget al，2024; 罗集光等，2011; Enders et al，2016）。因此，研究大菱鲆在不同养殖环境下的消化代谢节律变化，有助于揭示其适应环境变化的生理机制，为养殖环境优化提供理论依据，并为抗逆性状选育提供参考。
图3不同养殖环境下大菱鲆肠道淀粉酶活性水平的余弦分析和昼夜节律
Fig.3Cosine analysis and circadian rhythm of intestinal α-amylase activity in turbot under different aquaculture environment
a：低盐组 48 h；b：对照组 48 h；c：高温组 48 h；d：低盐组 72 h；e：对照组 72 h；f：高温组 72 h。
a: Low salinity group 48 h; b: Control group 48 h; c: High temperature group 48 h; d: Low salinity group 72 h; e:
在鱼类的生长发育过程中，消化酶活性起着至关重要的作用，它负责将食物中的大分子营养物质分解为可吸收的小分子，从而为生物体提供能量，支持生长和维持日常生命活动。研究鱼类的消化酶活动有助于理解其对环境变化的响应能力，尤其是在应激条件下对养殖效益的潜在影响。鱼类消化酶主要包括蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，这 3 类酶在鱼类能量代谢中扮演着关键角色，其活性水平通常受到环境因素（如温度、盐度和喂食时间等）的影响（孙博，2024; 纪凯等，2023; Solovyev et al，2022）。已有研究表明，不同环境条件会显著影响鱼类消化酶的活性，特别是在低盐或高温环境下，消化酶活性常发生显著变化。然而，针对长期环境胁迫下消化酶变化的连续监测研究仍较缺少，多数研究集中于短期胁迫反应（刘玲等，2018; 蒋飞等，2024），未能系统地探讨不同胁迫条件下消化酶的昼夜节律变化。
在本研究中，虽然 3 种消化酶的余弦节律分析未表现出显著性差异，但酶活性的变化仍然呈现一定的规律性，特别是在 48 h 以内的对照组和低盐组。这表明，即便在复杂的环境条件下，消化酶的昼夜波动仍与喂食行为紧密相关。具体而言，喂食后 2 h，3 种消化酶的活性达到峰值，而 6 h 后则降至低谷，类似的规律性变化也在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、塞内加尔鳎（Solea senegalensis）和大西洋鲑鱼（Salmo salar）等物种中得到验证（Guerra-Santos et al，2017; Navarro-Guillén et al，2015; Shi et al，2017）。这一节律性变化与鱼类的消化吸收过程密切相关，表明喂食后消化酶分泌的高峰有助于迅速消化摄入的食物。此规律性观察支持了消化酶活性与食物摄入之间的紧密联系，并为不同环境下的消化代谢节律提供了新的证据。关于低盐环境的影响，研究集中在短期低盐胁迫下消化酶活性的变化，这些研究表明，低盐环境通常会引起显著的生理变化，导致消化酶活性的波动（蒋飞等，2024; 尹飞等，2010）。例如，短期低盐胁迫会导致鱼类蛋白酶和脂肪酶含量显著下降，表明低盐可能会抑制某些消化过程（尹飞等，2010）。然而，本研究通过较长时间的实验设计，发现大菱鲆幼鱼在长期低盐环境下逐渐适应了这一胁迫，消化酶活性维持稳定，表明低盐对其消化系统的影响较小。与这些短期胁迫实验不同，本研究的结果表明，低盐并未对大菱鲆幼鱼产生显著的胁迫反应，鱼体可能通过代谢调节机制适应这一环境。相比之下，高温环境对消化酶活性的影响较为显著，打破了常规的规律性变化。在高温组，消化酶活性出现异常波动，尤其是脂肪酶的含量显著升高，这与高温胁迫下脂肪代谢加速的现象一致（Zhao et al，2021a）。脂肪酶的显著上升表明鱼体可能通过加速脂质的消耗来应对高温胁迫，是一种生理代偿机制。然而，过度的消化酶变化也可能反映鱼体在应对高温胁迫时的代谢负担加重，可能对长期生存产生负面影响。这样的结果也和本研究中的生长情况相一致，低盐组和对照组无显著生长差异，但显著优于高温组。
图4不同养殖环境下大菱鲆血清皮质醇含量的余弦分析和昼夜节律
Fig.4Cosine analysis and circadian rhythm of serum cortisol concentration in turbot under different aquaculture environment
a：低盐组 48 h；b：对照组 48 h；c：高温组 48 h；d：低盐组 72 h；e：对照组 72 h；f：高温组 72 h。
a: Low salinity group 48 h; b: Control group 48 h; c: High temperature group 48 h; d: Low salinity group 72 h; e: Control group 72 h; f: High temperature group 72 h.
在代谢物方面，葡萄糖、甘油三酯和胆固醇是鱼类重要的代谢物，参与糖代谢、脂代谢等过程。这些代谢物的动态变化，不仅反映鱼类的代谢状态，还可以作为衡量环境胁迫下机体适应能力的指标。不同的养殖环境会显著影响代谢物的变化，在逆境胁迫下，葡萄糖水平可能急剧波动（邵彦翔等，2017），表明糖代谢加快以应对急性能量需求；甘油三酯和胆固醇的变化则往往反映脂代谢的活跃程度（蔡润佳等，2021）。通过监测这些代谢物的变化，可以评估鱼类在不同环境中的代谢负担和应激反应。然而，现有研究多集中于短期胁迫后的代谢物变化或有限时间点的检测，较少进行长期动态监测，因此，对鱼类在动态环境中长期代谢适应性的研究尚显不足。
图5不同养殖环境下大菱鲆血清葡萄糖含量的余弦分析和昼夜节律
Fig.5Cosine analysis and circadian rhythm of serum glucose concentration in turbot under different aquaculture environment
a：低盐组 48 h；b：对照组 48 h；c：高温组 48 h；d：低盐组 72 h；e：对照组 72 h；f：高温组 72 h。
a: Low salinity group 48 h; b: Control group 48 h; c: High temperature group 48 h; d: Low salinity group 72 h; e: Control group 72 h; f: High temperature group 72 h.
本研究发现，葡萄糖的余弦节律不显著，胆固醇和甘油三酯的昼夜节律在对照组及低盐组中 48 h 内均显著。这可能与葡萄糖受摄食行为影响较大有关，这也与本研究中消化酶节律不显著的现象相一致。值得注意的是，胆固醇在夜间高于白天，表明脂代谢在白天更加活跃，这可能是由于白天能量需求增加，促使鱼类加速脂肪分解。低盐环境对脂代谢的影响已有较多研究，比如本团队前期研究发现，短期低盐胁迫可显著降低鱼类血清甘油三酯的含量（刘志峰等，2024），但对胆固醇的影响较小。本研究的结果进一步支持这一发现，长期低盐胁迫下，甘油三酯含量略低于对照组，表明低盐环境对甘油三酯代谢的抑制作用较弱。同时，葡萄糖的含量在低盐组与对照组之间无显著差异，进一步支持了长期低盐环境下糖代谢的稳定性，这与之前关于低盐胁迫对糖代谢影响较小的研究结果一致（赵磊等，2016）。长期低盐环境下，糖代谢的稳定性可能源于鱼类通过代谢调节机制对环境变化的适应能力。与低盐环境相比，高温环境对 3 种代谢物的余弦节律均未表现出显著性，且没有明显的波动规律，这表明高温对鱼类代谢产生了更大的胁迫效应。这也与已发表的研究结果相一致，高温环境常常导致鱼类代谢失衡，增加应激反应，并对脂质和糖类代谢产生重要影响（Zhao et al，2021b; 丰超杰等，2023）。另外，高温导致 3 个代谢物更剧烈的变化，以及更高的甘油三酯和胆固醇含量，这也与本研究中更高的脂肪酶相一致，表明高温环境可能通过显著增强脂肪代谢来应对能量需求急剧上升和代谢紊乱的发生（Zhao et al，2021a）。此外，皮质醇作为应对环境胁迫的关键激素，是衡量鱼类应激反应的重要指标（Ellis et al，2012），并参与鱼类的许多过程，能够通过促进蛋白质和脂肪的分解，增加葡萄糖的生成，帮助鱼类维持代谢平衡（Laiz-Carrión et al，2003）。在本研究中，对照组的皮质醇在 72 h 内表现出显著的节律性，而低盐组和高温组未表现出显著的节律性。这表明两种环境胁迫均影响了皮质醇的昼夜节律反应，但低盐组的皮质醇变化趋势与对照组相似，未表现出显著的胁迫反应。而高温组则表现出更高的皮质醇浓度，特别是在多个时间点显著升高，反映高温造成了更强烈的应激反应并促进代谢活动的增强。这与本研究中消化酶和代谢物的变化趋势高度一致，进一步表明高温对鱼类的代谢影响要大于低盐环境，也与本研究中的生长情况相一致。
图6不同养殖环境下大菱鲆血清甘油三酯含量的余弦分析和昼夜节律
Fig.6Cosine analysis and circadian rhythm of serum triglyceride concentration in turbot under different aqu
a：低盐组 48 h；b：对照组 48 h；c：高温组 48 h；d：低盐组 72 h；e：对照组 72 h；f：高温组 72 h。
a: Low salinity group 48 h; b: Control group 48 h; c: High temperature group 48 h; d: Low salinity group 72 h; e: Control group 72 h; f: High temperature group 72 h.
从整体趋势来看，本研究中消化代谢指标在实验的前 2 天表现出显著的余弦节律或规律性波动，而在第 3 天，规律性被打破，变化未再呈现波动性。这一波动失调现象在第 2 天接近结束时已经开始显现，可能与实验过程中鱼体数量逐渐减少有关，鱼群密度的降低可能削弱了群体对环境变化的集体响应能力（Anderson et al，2022），这也提示在未来进行长时间周期性采样实验时，应保证充足的实验用鱼基数，以提高数据的可靠性并减少由密度变化带来的潜在干扰。即便在具有显著节律的时间段内，不同环境条件下不同时间点的各检测指标数值排序仍存在差异。这表明仅依赖实验结束后单一时间点的采样数据可能无法全面、准确地反映鱼体的实际代谢状态，进而影响研究结果的准确性。因此，建议在实验设计中增加周期性取样点，有助于捕捉代谢指标的波动模式，从而获得更具代表性和精确性的结果。相较于高温处理，低盐处理对多个代谢指标的影响较小，这一结果与生长表现的差异一致。造成这一差异的可能原因有两方面：一是大菱鲆具有一定的耐低盐能力，而对高温的适应能力较弱；二是实验所用幼鱼来源于经过选育的亲本，这些亲本在低盐环境下表现出更强的适应性，继而影响其后代的生理表现。血清中的皮质醇和甘油三酯含量能够有效反映大菱鲆在不同环境胁迫条件下的健康状态和应激反应程度。此外，这些指标可作为抗逆性选育评估的参考，帮助筛选出耐高温或耐低盐的优良个体，为大菱鲆的抗逆性育种提供重要的理论依据。
图7不同养殖环境下大菱鲆血清胆固醇含量的余弦分析和昼夜节律
Fig.7Cosine analysis and circadian rhythm of serum cholesterol concentration in turbot under different aquaculture environment
a：低盐组 48 h；b：对照组 48 h；c：高温组 48 h；d：低盐组 72 h；e：对照组 72 h；f：高温组 72 h。
a: Low salinity group 48 h; b: Control group 48 h; c: High temperature group 48 h; d: Low salinity group 72 h; e: Control group 72 h; f: High temper
