摘要
石斑鱼(Epinephelus)养殖是我国海水养殖的重要产业之一，近年来规模化的种间杂交已成为石斑鱼繁育采用的普遍方法。石斑鱼种间杂交选育虽然有力促进了石斑鱼养殖业发展，但也为石斑鱼的种类鉴定和种质保存带来了困扰，且杂交斑逃逸也会对物种基因库造成污染。杂交斑兼具双亲的形态特征，仅根据形态鉴定比较困难。因此，迫切需要对杂交石斑鱼及其亲本进行精准判别和鉴定，以保障石斑鱼产业健康可持续发展。本研究在比较杂交石斑鱼 F1 代及其亲本形态学特征差异的基础上，使用线粒体基因 COⅠ和核基因 RYR3 双重分子标记对云龙石斑鱼(E. moara♀× E. lanceolatus♂)、虎龙杂交斑(E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂)、金虎杂交斑(E. fuscoguttatus♀× E. tukula♂)、杉虎斑(E. fuscoguttatus♀×E. polyphekadion♂)、龙鼠斑(C. altivelis♀×E. lanceolatus♂)等 5 种常见杂交斑进行亲本种源鉴定。结果显示，杂交斑体型与母本相似，例如，云龙石斑鱼、虎龙杂交斑、金虎杂交斑和杉虎斑均为椭圆形，而龙鼠斑头部尖突、背部隆起。杂交斑的体色和花纹兼具双亲特征，其中，金虎杂交斑和杉虎斑均与其双亲体色及花纹相似性较高，难以通过体色区分杂交后代与父母本；云龙石斑鱼、虎龙杂交斑、龙鼠斑则融合双亲颜色，表现出新的体色模式；5 种杂交斑与各自母本的 COⅠ基因遗传距离为 0.000~0.002，均小于 0.020；其系统发育树中，杂交斑均与各自母本聚为一支。可见，COⅠ基因能够准确甄别杂交斑的母本；鉴于杂交斑核基因携带双亲遗传信息，通过计算杂交斑的亲本间 RYR3 基因遗传距离范围(0.006~0.023)和构建系统发育树，可以有效区分每个纯种的石斑鱼，说明 RYR3 适合作为分子标记辅助 COⅠ基因用于杂交石斑鱼的父母本判别；基于上述结果，建立了 COⅠ与 RYR3 双重分子标记的杂交石斑鱼亲本种源鉴定方法。首先，根据待测样品的 RYR3 基因序列的杂合度判定是否为杂交斑；同时，经序列比对确认其亲本信息；如果为杂交斑，再结合 COⅠ鉴定结果甄别父母本；应用该方法对 16 份杂交石斑鱼样品的父母本进行种源鉴定，鉴定结果均与其记录双亲信息一致，表明杂交斑亲本种源鉴定方法可行有效。以上结果表明，COⅠ与 RYR3 双重分子标记技术可实现杂交石斑鱼亲本的准确判别，可为石斑鱼种质资源保护及其遗传育种提供重要参考。
Abstract
Grouper aquaculture constitutes an important industry within marine aquaculture in China. In recent years, inter-specific hybridization has emerged as a prevalent method for grouper breeding, with novel hybrid species, such as the Hulong and Yunlong groupers accounting for more than 70% of domestic grouper production. Although inter-specific hybrid selection has greatly advanced the development of the grouper industry, it has concurrently brought about challenges in species identification and germplasm preservation. In addition, introducing hybrid fish can contaminate the gene pool of species. Hybrid fish possess morphological characteristics of both parents, complicating morphological identification. Therefore, an urgent need exists for precise identification and authentication of hybrid groupers and their parents to ensure the healthy and sustainable development of the grouper industry. This study compared the morphological differences between F1 hybrids and their parents and used the mitochondrial gene COⅠ and nuclear gene RYR3 as dual molecular markers to trace the parents of five common hybrid species: Yunlong, Hulong, Jinhu grouper, Shanhu and Longshu groupers. The results showed the following: (1) The body shape of the hybrid resembled that of the maternal parent, with species, such as Yunlong, Hulong, Jinhu and Shanhu groupers, exhibiting an oval-shaped form, Longshu grouper had a pointed head and humpback. The color and pattern of hybrid groupers combined the characteristics of both parents, among which the Jinhu and Shanhu groupers exhibited high similarity with the color and pattern of their parents, complicating the differentiation between the hybrid offspring from parents based solely on color; conversely, the Yunlong, Hulong, and Longshu groupers exhibited new color patterns through the blending of parental colors. (2) The genetic distance between the five hybrid species and their maternal parents based on the COⅠ gene was 0.000–0.002, all less than 0.020; in their phylogenetic tree, hybrid species were clustered with their maternal parents. The COⅠ gene could accurately identify the maternal parent of hybrid species. (3) Given that nuclear genes transmitted genetic information from both parents, calculating the genetic distance between parental RYR3 genes of hybrids (range: 0.006–0.023) and constructing a phylogenetic tree could effectively distinguish each purebred grouper, indicating that RYR3 was suitable as a molecular marker to assist the COⅠ gene in identifying the parents of hybrid groupers. (4) Based on these results, a method for identifying the parents of hybrid groupers using COⅠ and RYR3 dual molecular markers was established. Initially, the determination of a sample as a hybrid was based on the heterozygosity of its RYR3 gene sequence; subsequent sequence comparison confirmed its parental information; if classified as a hybrid, the parents were identified using COⅠ results. (5) This method was utilized to identify the parents of 16 hybrid grouper samples, and the identification outcomes were consistent with their recorded parental information, demonstrating that the hybrid parent identification method was feasible and effective. These findings indicate that COⅠ and RYR3 dual molecular marker technology can accurately identify the parents of hybrid groupers, providing important insights for the conservation of stingray germplasm resources and genetic breeding.
Keywords
石斑鱼（Epinephelus）不仅是热带、亚热带近岸岩滩和珊瑚礁渔业的典型代表（李明德，2012），而且已成为驰名世界的名贵水产鱼类，是我国海水鱼产业技术体系的 9 大主养品种之一。近 10 年，我国石斑鱼养殖产量不断攀升，2023 年养殖产量达到 24.15 万 t，约占全国海水养殖鱼类产量的 11.74%（农业农村部渔业渔政管理局等，2024）。其中，虎龙杂交斑（E. fuscoguttatus♀ × E. lanceolatus♂）、云龙石斑鱼（E. moara♀ × E. lanceolatus♂）等通过种间杂交创制的石斑鱼新品种因具有生长速度快、抗逆性强等杂交优势而产量剧增，目前已占国内石斑鱼养殖市场产量的 70%以上。规模化的种间杂交已成为当前石斑鱼繁育产业普遍采用的方法，但不容忽视的是，一方面，杂交石斑鱼兼具双亲的形态特征，很难辨别，使其极易混入亲本群体，且杂交石斑鱼具有繁育的可能性（田永胜等，2024），作为亲本易导致后代的品质衰退； 另一方面，杂交个体的逃逸可能会挤占野生群体生存资源，对野生种群基因库的多样性造成一定影响，不利于种质资源的保护（曲朦等，2015）。因此，对杂交石斑鱼进行亲本种源鉴定以实现其准确鉴别是保障石斑鱼产业长期健康发展的基础。
线粒体结构简单、无重组、多数母性遗传，已成为研究的有力工具（陈兴汉等，2014）。COⅠ基因是硬骨鱼类的 DNA 条形码标准基因，在石斑鱼物种鉴定、系统发育学研究、群体遗传结构分析等领域广泛应用（梁日深等，2021; 龚师锐等，2024; Sachithanandam et al，2022）。核基因 RYR3 包含父母的双亲基因，生物学信息量更为丰富（梁爽，2017）。有学者使用核基因 RYR3 标记对沙带鱼（Lepturacanthus savala）（谷穗，2022）、青石斑鱼（E. awoara）（刘瑞祺，2020）、大黄鱼（Larimichthyscrocea）（马军凯，2021）、双带缟虾虎鱼（Tridentiger bifasciatus）等（陈月华，2017; 邓颖达，2016; 顾翠平，2014）进行群体遗传学研究，探讨鱼类的亲缘地理关系。Qu 等（2018）对包含 RYR3 在内的 12 个核基因进行筛选，评估其作为石斑鱼物种鉴定标记的适用性， RYR3 为最适宜的分子标记。
建立杂交石斑鱼亲本种源鉴定方法是进行石斑鱼种质鉴定和杂交育种的基础。本研究在描述杂交斑形态学特征基础上，采用线粒体 COⅠ基因和 RYR3 核基因双重分子标记，建立杂交石斑鱼父母本种源鉴定方法，以期解决石斑鱼杂交种鉴定的难点问题，为石斑鱼养殖产业健康发展和种质资源保护与可持续开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
样品采自日本东京湾海域和我国的海南、广东、福建、山东等沿海地区的石斑鱼养殖场和科研基地。采集云龙石斑鱼、虎龙杂交斑、金虎杂交斑（E. fuscoguttatus♀ × E. tukula♂）、杉虎斑（E. fuscoguttatus♀ × E. polyphekadion♂）、龙鼠斑（C. altivelis♀ × E. lanceolatus♂）等 5 种常见杂交斑个体共 43 尾，其中，27 尾用于杂交斑亲本种源鉴定方法的建立，16 尾用于方法验证；采集杂交斑对应的 6 种纯种石斑鱼亲本个体共 46 尾，其中，29 尾用于杂交斑亲本种源鉴定方法的建立，17 尾用于方法验证（表1）。首先，记录杂交斑及纯种石斑鱼亲本的体型、体色和花纹等外部形态特征；然后，取肌肉或鳍条固定于 95%酒精中备用。
表1石斑鱼样品信息
Tab.1Sample information of groupers
1.2 实验方法
1.2.1 形态特征描述
体型、体色和花纹是石斑鱼分类的重要判别依据。本研究参考 Craig 等（2011）编著的《Groupers of the World》形态分类标准对 5 种杂交石斑鱼及其亲本的形态特征进行描述和比较。
1.2.2 DNA 提取与序列扩增
利用海洋动物组织 DNA 提取试剂盒（北京天根）进行 DNA 提取。使用 Nano-300 微量分光光度计进行 DNA 浓度和纯度测定。
本研究扩增的基因片段为线粒体 COⅠ基因与核基因 RYR3，引物信息及 PCR 条件见表2。RYR3 基因优先使用一对 Inner 引物进行扩增，对于扩增效果不好的样品再使用巢氏引物进行扩增。PCR 体系总体积为 25 μL，其中包括 2×Rapid Taq Master Mix（南京诺唯赞）12 μL、灭菌水 8 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL、DNA 样品 3 μL。PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测后送往北京六合华大基因公司进行双向测序。
表2引物信息及 PCR 条件
Tab.2Primer information and PCR conditions
1.2.3 基因克隆
将 RYR3 的 PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，然后连接到 pEASY-T1 Cloning Vector（北京全式金）中，根据菌落生长情况于 37℃恒温培养 12~16 h，每个平板挑取 10 枚单克隆菌落进行测序。
1.2.4 数据分析方法
运用 SeqMan 软件对测序所得到的正向序列和反向序列进行拼接，并辅助测序峰图进行人工校正，序列经 NCBI 的 Blast 工具进行相似性比对。利用 MEGA 7.0 软件，基于 Kimura2-Parameter 模型计算遗传距离并构建 NJ 系统发育树。
2 结果
2.1 杂交斑及其亲本的形态特征比较
按照《Groupers of the World》的分类标准，杂交斑亲本的主要形态特征见表3。由于杂交石斑鱼的遗传物质来自两个不同的亲本，因此杂交斑均在一定程度上保留了双亲的形态特征，但也表现出不同于亲本的新特征。通过对杂交石斑鱼的形态观察发现，云龙石斑鱼体呈长椭圆形、侧扁，体侧分布 3~5 条黑褐色横带，各横带中间嵌有不规则的白斑，尾鳍及头部为黑白相间的斑块，杂交斑与母本云纹石斑鱼（E. moara）斑纹相似，在此基础上融合了父本鞍带石斑鱼（E. lanceolatus）的斑纹特征，表现为更加规则的横带斑。虎龙杂交斑鱼体呈长椭圆形、侧扁，体色较深，其背鳍和尾鳍上也有黑色小斑点，杂交斑表现出异于亲本的新型颜色模式，体侧分布大型的黑白黄相间的不规则环状斑，仅在鳍部保留了类似于母本棕点石斑鱼（E. fuscoguttatus）的深色圆形斑点，体侧分布黑黄相间的环状斑融入了父本鞍带石斑鱼的黄色条带特征。金虎杂交斑鱼体呈长椭圆形、侧扁，身体呈棕褐色，体表布满深褐色圆点，体中部有较大块不规则黑色斑，体表斑纹具有与母本棕点石斑鱼相同的特征，但体表颜色表现为比亲本更浅的褐色。杉虎斑鱼体呈长椭圆形、侧扁，身体黑灰色，全身布满黑褐色圆点，背鳍棘基部有少量黑色圆斑聚集一团，杂交斑双亲的体色差异不明显，整体的颜色模式与父母本相似性较高。龙鼠斑身体侧扁，头部较尖，背部隆起，体表为黑白相间的不规则花纹，背鳍后方及尾鳍有黑色圆点，身体后端有 3 条明显深褐色竖纹，结合了母本驼背鲈（Cromileptes altivelis）的体型特征，保留了父本鞍带石斑鱼体表的斑纹特征，同时颜色深浅变化又更加明显。这些特征进一步证实了杂交石斑鱼在形态上与双亲存在的紧密联系，尽管在某些方面表现出一定的差异，但也反映出杂交子代在性状表达的不同层面受控于双方亲本（王燕等，2014），同时为其准确鉴别提供了重要的参考依据。
表3石斑鱼亲本的形态特征
Tab.3Morphological characteristics of grouper parents
2.2 COⅠ基因序列分析
2.2.1 基于 COⅠ基因的遗传距离分析
经计算，本研究自测的 5 种杂交斑及其亲本的 COⅠ序列遗传距离为 0.000~0.173（表4）。其中，5 种杂交斑与各自母本的遗传距离为 0.000~0.002，均小于 Hebert 等（2003）推荐的区分物种的最小种间遗传距离（0.02）。这表明杂交斑和母本的 COⅠ序列基本一致，利用 COⅠ 基因序列可以对杂交斑的母本来源进行准确鉴别。
2.2.2 系统发育分析
使用 11 条自测的 5 种杂交斑及 6 种亲本的 COⅠ序列和 18 条从 NCBI 数据库中下载的 6 种亲本的线粒体 COⅠ基因序列构建了 NJ 系统发育树，其中，豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）为外类群。自测的杂交斑亲本序列与 NCBI 数据库中的参考序列均以较高的支持率分别聚类，且 5 种杂交斑分别与其母本各自聚类，如杉虎斑、金虎杂交斑、龙虎斑与其母本棕点石斑鱼聚为一支；云龙石斑鱼与其母本云纹石斑鱼聚为一支；龙鼠斑与其母本驼背鲈聚为一支（图1），说明杂交斑与其母本的 COⅠ序列相近，可以对杂交斑的母本进行准确鉴别。
2.3 RYR3 基因序列分析
2.3.1 RYR3 基因遗传距离
由于杂交斑的核基因携带双亲的遗传序列，故对 6 种杂交斑亲本的序列进行分析。杂交斑亲本间的 RYR3 基因的遗传距离范围为 0.006~0.023，遗传距离最大为鞍带石斑鱼和清水石斑鱼（E. polyphekadion）（0.023），其次为鞍带石斑鱼与棕点石斑鱼以及鞍带石斑鱼与驼背鲈（0.020）。最小遗传距离为云纹石斑鱼和棕点石斑鱼（0.006）（表5）。说明几种杂交斑的亲本间的 RYR3 基因可能具有较高的遗传相似性，需进一步通过进化树分析其区分物种的效果。
2.3.2 RYR3 基因系统发育关系
使用自测的 6 条杂交斑亲本序列和 NCBI 数据库中下载的 17 条石斑鱼 RYR3 基因序列，以豹纹鳃棘鲈作为外类群构建了 NJ 系统发育树（图2）。系统发育树显示，6 种亲本之间以较高的支持率各自形成独立分支，且自测序列与 NCBI 参考序列能较好聚类，展现出与 COⅠ系统发育相似的拓扑结构，可以较好地对以上 6 种杂交斑的亲本进行物种区分。与 COⅠ基因相比，RYR3 基因过于保守，不能单独作为条形码基因鉴别物种，但可以作为合适的标记辅助 COⅠ基因种间杂种。
2.4 杂交斑及其父母本的甄别
为了进一步验证杂交斑的亲本来源，可以通过结合 RYR3 基因与 COⅠ基因的鉴定结果，准确区分杂交斑的母本和父本。由于 RYR3 核基因携带了双亲的遗传序列，将杂交斑 RYR3 基因克隆后的序列经 NCBI 比对后若得到 2 种不同石斑鱼，即可结合 COⅠ鉴定结果确定杂交斑母本，另一种则为杂交斑的父本。将杂交斑及其父母本鉴定流程整理如下（图3）：
（1）对收集到的石斑鱼样品进行简单的形态学鉴定，随后进行样品处理及组织取材。（2）提取 DNA，对每个样品的 COⅠ基因和 RYR3 基因进行 PCR 扩增及测序。（3）如果 RYR3 序列峰图无单核苷酸杂合位点，则直接判断该待测个体为纯种石斑鱼。将 COⅠ和 RYR3 两个基因的序列与 NCBI 数据库比对，确定物种信息；如果 RYR3 序列峰图存在多个单核苷酸杂合位点（通常为 3~6），则该待测个体可能为杂交石斑鱼。进一步将 RYR3 基因的 PCR 产物纯化并克隆测序，得到分别来自父本和母本的 2 条 RYR3 等位基因序列，结合母系遗传的 COⅠ基因序列比对结果，便可确定杂交个体的双亲信息。
表4杂交斑及其亲本的CO I 基因遗传距离
Tab.4Genetic distance of CO I gene between hybrid groupers and its parents
图15 种杂交斑及其亲本的 COⅠ基因序列 NJ 系统树
Fig.1NJ phylogenetic tree of the COⅠgene sequences of 5 hybrid species and their parents
表56 种亲本的 RYR3 基因遗传距离
Tab.5Genetic distance of RYR3 gene between hybrid groupersʹ parents
2.5 杂交斑亲本种源鉴定方法的验证
基于上述流程，本研究鉴定出杂交斑对应的 6 种纯种石斑鱼亲本个体（表6），并成功对虎龙杂交斑（棕点石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂）、金虎杂交斑（棕点石斑鱼 ♀×蓝身大斑石斑鱼♂）、云龙石斑鱼（云纹石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂）、杉虎斑（棕点石斑鱼♀×清水石斑鱼♂）、龙鼠斑（驼背鲈♀×鞍带石斑鱼♂）5 种杂交石斑鱼共 16 个个体的父本和母本进行种源鉴定（表7）。
图2杂交斑亲本的 RYR3 基因序列 NJ 系统树
Fig.2NJ phylogenetic tree of RYR3 gene sequences in hybrid grouper parents
图3杂交斑父母本种源鉴定流程图
Fig.3Hybrid grouper parental source identification flowchart
3 讨论
3.1 杂交斑的形态特征
形态特征相似及体色花纹的易变性是石斑鱼类的普遍特点，杂交石斑鱼更是具有双亲的形态特征，导致与纯种的石斑鱼在外观上难以区分；不同的环境因素如养殖条件、水质、饲料等也可能影响杂交斑的形态表现，增加了鉴定的难度；加之杂交斑的遗传背景尚不明确，不同的杂交组合可能会产生不同的形态特征，使得鉴定更加困难。如文中提到的棕点石斑鱼、清水石斑鱼与杉虎杂交斑三者的外部形态在体型与体表斑纹等方面尤其相似；龙虎杂交斑、云龙杂交斑、金虎杂交斑三者不仅体型与体色相近，体表的花纹也十分相似，均分布有黑白相间的不规则斑块，再加上三者本身在种内的花纹变异也无规律可循，更增加了形态上的辨识难度。故依靠形态学特征不能全面地将所有的杂交斑与其双亲区分开。因此，采用分子标记的方法进行石斑鱼种类的鉴定是必要的。
表6纯种石斑鱼鉴定结果
Tab.6Identification results of purebred grouper
3.2 杂交斑分子鉴定方法
近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，尤其是 DNA 测序技术的日益完善，越来越多的研究者尝试利用分子标记进行杂交石斑鱼的鉴定。郑乐云（2014）分析并证实了云纹石斑鱼（♀）和赤点石斑鱼（E. akaara）（♂）杂交子代线粒体相关基因遵循母性遗传规律；李振通（2021）对云纹石斑鱼（♀）×蓝身大斑石斑鱼（♂）杂交子代的线粒体结构和系统进化进行分析也发现了这一规律，为杂交斑母本种源鉴定分析提供了可靠依据。本研究通过对杂交斑及其亲本的 COⅠ 序列进行分析也符合这一规律。
针对杂交石斑鱼父本鉴定的研究还缺少系统和标准化的方法。王同等（2024）对杉虎斑（棕点石斑鱼♀×清水石斑鱼♂）杂交子代及其亲本的遗传特征进行分析，筛选出了 6 对微卫星标记引物可以在部分群体中扩增出特异性条带以区分杂交子代与其父母本。杜佳莹等（2006）结合 RAPD 和 AFLP 标记检测，获得了可以鉴别点带石斑鱼（E. coioides）、斜带石斑鱼（E. coioides）及其杂种子代的特异性分子标记，根据线粒体 DNA Cytb 基因母系遗传的特性并结合形态特征可以推测杂交子代的父母本来源。Qu 等（2018）在虎龙杂交斑（棕点石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂）、斜带石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂、赤点石斑鱼♀×云纹石斑鱼♂、珊瑚石斑鱼（E. corallicola）♀×棕点石斑鱼♂以及斜带石斑鱼和鞍带石斑鱼的正反交子代，共 6 种杂交个体中检验了利用 RYR3 核标记鉴定杂交种的可行性。以上方法虽在某些特定石斑鱼物种杂交子代中实现了亲本种源鉴定，但缺乏一定的普适性和通用性。本研究通过对 5 种杂交斑及其亲本的 RYR3 基因序列进行遗传距离和系统发育分析，结果也表明其可以作为区分该 5 种杂交斑亲本的候选分子标记。COⅠ基因作为线粒体 DNA 标记，具有母系遗传特性；而 RYR3 作为核基因则具有双亲遗传特性，可以提供额外的遗传信息辅助 COⅠ基因鉴别杂交种，帮助区分不同亲本的遗传特征。两种标记联合使用可以相互验证和补充，同时能更全面地覆盖杂交石斑鱼的遗传多样性，可以增强鉴定的准确性和稳定性。
3.3 杂交斑分子鉴定方法应用评价
本研究的方法验证结果表明，利用 COⅠ和 RYR3 双重分子标记，可以为鉴定 F1 代杂交石斑鱼提供一种有效的方法。COⅠ基因可以准确鉴别杂交斑母本， RYR3 作为核基因携带了双亲的遗传信息，可以辅助COⅠ基因鉴定杂交种。结合 COⅠ和 RYR3 两种标记，可以准确地对杂交斑的父母本进行鉴别，鉴别效率为 100%。本方法具有操作简便、结果准确、可重复性高等优点；同时，基于线粒体 DNA 和核 DNA 的联合分析策略，提高了亲本种源鉴定的分辨率和可靠性。在石斑鱼育种实践中，该方法可用于亲本选配、后代鉴定和良种选育等方面，提高育种效率和品种质量。由于本研究可能受到样本数量的限制，无法涵盖所有潜在的杂交组合或地理来源，这可能导致对杂交石斑鱼的真实多样性和分布情况理解不足。此外，RYR3 基因虽然在石斑鱼类中表现出良好的种间变异特性，但对于其他种类的鱼类或其他生物，RYR3 基因是否适用于物种鉴别尚需进一步验证。
表7杂交斑鉴定结果
Tab.7Identification results of hybrid grouper
