《渔业科学进展》虚拟专辑——对虾疾病：虾肝肠胞虫(EHP)
虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)是一种严格细胞内寄生的微孢子虫，成熟的孢子呈椭圆形，大小为(1.4±0.3)×(0.8±0.1) μm，后端有1个空泡，胞内含1个细胞核，5~6圈极丝，1个与极丝相连的锚定盘和1层电子致密的孢子壁。EHP于2009年首次从斑节对虾(Penaeus monodon)中发现并命名，感染EHP的对虾往往正常进食，但生长缓慢甚至停滞，直接影响到养殖产量，给养殖户带来严重的经济损失，如何预防和治疗EHP已经成为对虾养殖产业急需解决的科学问题。
编辑部整理了近年来发表在本刊上的8篇关于虾肝肠胞虫研究论文组成本期虚拟专辑，欢迎阅读、引用。
2022, 43(4):218-225.
DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20210422001
摘要:
近年来，虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)流行使我国养殖对虾遭受严重经济损失，现场快速检测是EHP防控的重要技术保证。本研究对本实验室研发的EHP现场快速检测试剂盒的分析特异性(ASp)、分析灵敏度(ASe)、诊断特异性(DSp)、诊断灵敏度(DSe)、重复性和稳定性6项性能参数开展了系统评估。ASp测试显示，该试剂盒与对虾白斑综合征病毒(WSSV)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)等5种对虾常见病原及健康对虾无交叉反应；ASe测试显示，该试剂盒检测下限为101 copies/反应；以EHP TaqMan RT-qPCR方法为标准，比较了试剂盒对298份临床样品的测试结果，试剂盒的DSp为99.2%、DSe为91.7%；试剂盒对EHP阴性样品及强阳性样品的检测重复率为100%，弱阳性样品检测重复率为95.8%；试剂盒在–20℃和–40℃条件下分别可保存7个月和12个月以上。本研究表明，本实验室研制的EHP现场快速检测试剂盒具操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好和稳定性强等优点，可满足对虾养殖现场对EHP的高灵敏度检测。
近年来，虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)流行使我国养殖对虾遭受严重经济损失，现场快速检测是EHP防控的重要技术保证。本研究对本实验室研发的EHP现场快速检测试剂盒的分析特异性(ASp)、分析灵敏度(ASe)、诊断特异性(DSp)、诊断灵敏度(DSe)、重复性和稳定性6项性能参数开展了系统评估。ASp测试显示，该试剂盒与对虾白斑综合征病毒(WSSV)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)等5种对虾常见病原及健康对虾无交叉反应；ASe测试显示，该试剂盒检测下限为101 copies/反应；以EHP TaqMan RT-qPCR方法为标准，比较了试剂盒对298份临床样品的测试结果，试剂盒的DSp为99.2%、DSe为91.7%；试剂盒对EHP阴性样品及强阳性样品的检测重复率为100%，弱阳性样品检测重复率为95.8%；试剂盒在–20℃和–40℃条件下分别可保存7个月和12个月以上。本研究表明，本实验室研制的EHP现场快速检测试剂盒具操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好和稳定性强等优点，可满足对虾养殖现场对EHP的高灵敏度检测。
2022, 43(3):75-83.
DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20210302001
摘要:
为探究虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)感染对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)肠道菌群的影响，本研究基于16S rRNA基因的测序结果，对感染EHP的脊尾白虾肠道菌群进行了分析。结果显示，感染虾与健康虾肠道菌群差异较大，且其肠道菌群结构多样性显著低于健康虾。研究发现，病虾中归属于变形菌门(Proteobacteria)的脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、未分类蓝细菌科(unidentified Cyanobacteria)、支原体科(Mycoplasmataceae)和未分类α变形菌科(unidentified Alphaproteobacteria)为优势菌，而归属于厚壁菌门(Firmicutes)的乳杆菌科(Lactobacillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)及噬几丁质杆菌科(Chitinophagaceae)细菌在健康虾中占据优势地位。EHP侵蚀导致感染虾肠道内潜在致病菌显著增加(P<0.05)，增加了其他疾病的易感性。此外，通过Tax4Fun功能预测，发现感染虾肠道菌群主要用于新陈代谢，从而抵抗EHP侵染，维持机体正常功能；健康虾肠道菌群则多用于个体生长与环境信息处理，进而保证生长与存活。本研究从虾肠道菌群结构方面入手，进一步探究了EHP感染对脊尾白虾肠道菌群的影响，以期为EHP的防治提供帮助。
为探究虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)感染对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)肠道菌群的影响，本研究基于16S rRNA基因的测序结果，对感染EHP的脊尾白虾肠道菌群进行了分析。结果显示，感染虾与健康虾肠道菌群差异较大，且其肠道菌群结构多样性显著低于健康虾。研究发现，病虾中归属于变形菌门(Proteobacteria)的脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、未分类蓝细菌科(unidentified Cyanobacteria)、支原体科(Mycoplasmataceae)和未分类α变形菌科(unidentified Alphaproteobacteria)为优势菌，而归属于厚壁菌门(Firmicutes)的乳杆菌科(Lactobacillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)及噬几丁质杆菌科(Chitinophagaceae)细菌在健康虾中占据优势地位。EHP侵蚀导致感染虾肠道内潜在致病菌显著增加(P<0.05)，增加了其他疾病的易感性。此外，通过Tax4Fun功能预测，发现感染虾肠道菌群主要用于新陈代谢，从而抵抗EHP侵染，维持机体正常功能；健康虾肠道菌群则多用于个体生长与环境信息处理，进而保证生长与存活。本研究从虾肠道菌群结构方面入手，进一步探究了EHP感染对脊尾白虾肠道菌群的影响，以期为EHP的防治提供帮助。
2020, 41(6):165-173.
DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20190810002
摘要:
分泌蛋白是在细胞内合成后分泌到细胞外起作用的蛋白质，其在许多原生动物寄生虫操纵宿主细胞和影响虫体的毒力中起着重要作用。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是一种可感染多种经济虾类的专性细胞内寄生虫，是近年来影响全球对虾养殖生产较严重的病害之一。本研究利用真核生物分泌蛋白预测流程EuSecPred2.0对EHP全基因组的分泌蛋白进行预测，并对分泌蛋白长度、信号肽长度、切割位点处氨基酸分布等信息进行分析，对分泌蛋白功能进行分析。结果显示，分泌蛋白氨基酸长度主要集中在30~400 aa之间；信号肽长度集中在9~32 aa之间；信号肽切割位点处以疏水性氨基酸为主。对信号肽进行基序分析，发现存在基序NV[VT][IK]CA[ED][SA]。对所获蛋白质进行功能注释，发现了多种与微孢子虫黏附侵染、调节细胞周期和免疫反应等相关的关键蛋白。研究结果有助于了解EHP对宿主的侵染机制，同时为进一步明确EHP的致病相关因子提供理论依据。
分泌蛋白是在细胞内合成后分泌到细胞外起作用的蛋白质，其在许多原生动物寄生虫操纵宿主细胞和影响虫体的毒力中起着重要作用。虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)是一种可感染多种经济虾类的专性细胞内寄生虫，是近年来影响全球对虾养殖生产较严重的病害之一。本研究利用真核生物分泌蛋白预测流程EuSecPred2.0对EHP全基因组的分泌蛋白进行预测，并对分泌蛋白长度、信号肽长度、切割位点处氨基酸分布等信息进行分析，对分泌蛋白功能进行分析。结果显示，分泌蛋白氨基酸长度主要集中在30~400 aa之间；信号肽长度集中在9~32 aa之间；信号肽切割位点处以疏水性氨基酸为主。对信号肽进行基序分析，发现存在基序NV[VT][IK]CA[ED][SA]。对所获蛋白质进行功能注释，发现了多种与微孢子虫黏附侵染、调节细胞周期和免疫反应等相关的关键蛋白。研究结果有助于了解EHP对宿主的侵染机制，同时为进一步明确EHP的致病相关因子提供理论依据。
2019, 40(3):122-132.
DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20180421002
摘要:
对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样，采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量，再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样，检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度，定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性，比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明，检测灵敏度过低，会降低高并样率检测的准确性；阳性率在30%以上时，高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好；高载量感染的阳性率不低于6.7%时，50∶1以内的并样能准确得出检测结果；低载量感染的阳性率不低于16%时，25∶1以内的并样能得出较好结果；高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果；各种并样模式均有很好的诊断特异性，50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近；各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围，二者存在极显著相关性，各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。
对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样，采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量，再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样，检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度，定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性，比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明，检测灵敏度过低，会降低高并样率检测的准确性；阳性率在30%以上时，高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好；高载量感染的阳性率不低于6.7%时，50∶1以内的并样能准确得出检测结果；低载量感染的阳性率不低于16%时，25∶1以内的并样能得出较好结果；高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果；各种并样模式均有很好的诊断特异性，50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近；各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围，二者存在极显著相关性，各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。
2018, 39(4):83-92.
摘要:
对来自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体进行了对虾生长参数测量，用TaqMan qPCR检测了凡纳滨对虾各群体的肝胰腺组织中和RZ群体多种组织中的虾肝肠胞虫数量(Amount of Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)。结果显示，在主要生长相关参数中，RZ群体最优，该群体EHP载量也最低。不同群体的样本数EHP对数直方图的模式存在差异，HH和PD群体的EHP对数呈双峰分布，而WJ和RZ群体的EHP对数呈单峰分布，代表EHP在不同群体中可能存在不同的传播模式。EHP对数呈单峰分布的群体或从多峰分布的群体中分离出的高EHP对数子群体的对虾体长或体重与EHP对数呈显著的负相关。RZ群体中，各个体不同组织中EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺>中肠>血淋巴>鳃>肌肉。肝胰腺、中肠和鳃3个组织中EHP对数相互间的相关性为99.9%的极显著水平(P<0.001)；除了中肠与血淋巴和肝胰腺与血淋巴以外，其余组织间EHP对数的相关性也达到极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)水平。用DIG标记的EHP探针对肝胰腺、肌肉、鳃、肠道组织的原位杂交显示，肝胰腺是主要的EHP感染组织，其他组织中杂交信号较弱，但各组织中有少数细胞的EHP易感。
对来自河北黄骅(HH)、山东平度(PD)、江苏吴江(WJ)和山东日照(RZ)的4个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体进行了对虾生长参数测量，用TaqMan qPCR检测了凡纳滨对虾各群体的肝胰腺组织中和RZ群体多种组织中的虾肝肠胞虫数量(Amount of Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)。结果显示，在主要生长相关参数中，RZ群体最优，该群体EHP载量也最低。不同群体的样本数EHP对数直方图的模式存在差异，HH和PD群体的EHP对数呈双峰分布，而WJ和RZ群体的EHP对数呈单峰分布，代表EHP在不同群体中可能存在不同的传播模式。EHP对数呈单峰分布的群体或从多峰分布的群体中分离出的高EHP对数子群体的对虾体长或体重与EHP对数呈显著的负相关。RZ群体中，各个体不同组织中EHP从高到低的顺序依次是肝胰腺>中肠>血淋巴>鳃>肌肉。肝胰腺、中肠和鳃3个组织中EHP对数相互间的相关性为99.9%的极显著水平(P<0.001)；除了中肠与血淋巴和肝胰腺与血淋巴以外，其余组织间EHP对数的相关性也达到极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)水平。用DIG标记的EHP探针对肝胰腺、肌肉、鳃、肠道组织的原位杂交显示，肝胰腺是主要的EHP感染组织，其他组织中杂交信号较弱，但各组织中有少数细胞的EHP易感。
2017, 38(4):96-103.
DOI: 10.11758/yykxjz.20160418002
摘要:
对采自天津、浙江和山东等养殖场5个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体的442尾个体进行虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)的TaqMan探针荧光定量PCR检测，并测量各群体每尾对虾的生物学体长和体重。引入医学上的劳累尔(Rohrer)体重指数(Ponderal index, PI, W/L3)关系建立对虾体重(W)和体长(L)关系函数。结果显示，4个凡纳滨对虾的EHP阳性群体[平均体长为(5.37±1.19) cm]的体重指数PI平均值为(5.19±0.26)×10–3 g/cm3，EHP阴性群体的凡纳滨对虾群体[平均体长为(2.49±0.21) cm]为(7.96±0.51)×10–3 g/cm3，根据PI =a·L(b–3)的函数矫正EHP阴性和阳性群体的体长差异引起的PI差值后，同等体长EHP阳性群体的PI值为阴性群体的(70.5±8.7)%，表明同样大小的个体，EHP阳性群体的平均体重比阴性群体平均体重低30%；EHP阳性群体中凡纳滨对虾体长和体重的变异系数是EHP阴性群体的(2.39±0.93)和(2.05±0.86)倍，表现为对虾EHP阳性群体个体大小不均匀；EHP阳性群体体重偏差率是EHP阴性群体的2.34–3.45倍，体长相同时，EHP阳性的体重波动变大。
对采自天津、浙江和山东等养殖场5个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)群体的442尾个体进行虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)的TaqMan探针荧光定量PCR检测，并测量各群体每尾对虾的生物学体长和体重。引入医学上的劳累尔(Rohrer)体重指数(Ponderal index, PI, W/L3)关系建立对虾体重(W)和体长(L)关系函数。结果显示，4个凡纳滨对虾的EHP阳性群体[平均体长为(5.37±1.19) cm]的体重指数PI平均值为(5.19±0.26)×10–3 g/cm3，EHP阴性群体的凡纳滨对虾群体[平均体长为(2.49±0.21) cm]为(7.96±0.51)×10–3 g/cm3，根据PI =a·L(b–3)的函数矫正EHP阴性和阳性群体的体长差异引起的PI差值后，同等体长EHP阳性群体的PI值为阴性群体的(70.5±8.7)%，表明同样大小的个体，EHP阳性群体的平均体重比阴性群体平均体重低30%；EHP阳性群体中凡纳滨对虾体长和体重的变异系数是EHP阴性群体的(2.39±0.93)和(2.05±0.86)倍，表现为对虾EHP阳性群体个体大小不均匀；EHP阳性群体体重偏差率是EHP阴性群体的2.34–3.45倍，体长相同时，EHP阳性的体重波动变大。
2017, 38(2):158-166.
DOI: 10.11758/yykxjz.20160123001
摘要:
2013年，河北、天津等地区养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育苗期出现死苗、出苗率低的情况，生产上，仔虾个体大小差异较大，造成了严重损失。本研究采用荧光定量PCR方法(Real-time PCR)对天津大港地区采集的108尾凡纳滨对虾仔虾样品进行单尾病原检测。结果显示，传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)均有检出。IHHNV阳性检出率100%，每微克对虾组织DNA的病毒拷贝数为103–107，且个体较大的样品(1.2–2.0 cm)携带病毒拷贝数偏高；EHP阳性检出率为49.1%，每微克对虾组织DNA的拷贝数为103–105，且集中于个体较小样品(0.7–1.1 cm)。对IHHNV和EHP阳性凡纳滨对虾样品进行生物学体长与病毒载量指数相关性分析，显示IHHNV载量指数与对虾生长速率呈正相关，虾组织IHHNV平均载量达8.51×104 copies/μg DNA，为较高的感染水平；EHP的载量与对虾生长速率呈负相关关系，与较大个体阳性检出率较低相对应，虾组织EHP平均载量达到2.19×104 copies/μg DNA，为较高的感染水平。由此，该批凡纳滨对虾仔虾患病为IHHNV和EHP的混合感染所致，本研究数据为IHHNV和EHP病原混合感染流行情况及其对养殖育苗期仔虾生长的影响提供科学依据。
2013年，河北、天津等地区养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育苗期出现死苗、出苗率低的情况，生产上，仔虾个体大小差异较大，造成了严重损失。本研究采用荧光定量PCR方法(Real-time PCR)对天津大港地区采集的108尾凡纳滨对虾仔虾样品进行单尾病原检测。结果显示，传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)均有检出。IHHNV阳性检出率100%，每微克对虾组织DNA的病毒拷贝数为103–107，且个体较大的样品(1.2–2.0 cm)携带病毒拷贝数偏高；EHP阳性检出率为49.1%，每微克对虾组织DNA的拷贝数为103–105，且集中于个体较小样品(0.7–1.1 cm)。对IHHNV和EHP阳性凡纳滨对虾样品进行生物学体长与病毒载量指数相关性分析，显示IHHNV载量指数与对虾生长速率呈正相关，虾组织IHHNV平均载量达8.51×104 copies/μg DNA，为较高的感染水平；EHP的载量与对虾生长速率呈负相关关系，与较大个体阳性检出率较低相对应，虾组织EHP平均载量达到2.19×104 copies/μg DNA，为较高的感染水平。由此，该批凡纳滨对虾仔虾患病为IHHNV和EHP的混合感染所致，本研究数据为IHHNV和EHP病原混合感染流行情况及其对养殖育苗期仔虾生长的影响提供科学依据。
2016, 37(2):119-126.
DOI: 10.11758/yykxjz.20150512003
摘要:
根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) SSU rDNA序列设计1对特异性引物，建立并优化了EHP的SYBR Green I实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法。结果显示，该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好，产物的熔解曲线为1个单峰，构建的方法对8.3×101–8.3×108 copies/µl的EHP SSU rDNA片段的检测响应具有良好的线性关系，扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=–3.369 log(Sq)+39.364 (R2=0.992)，扩增效率为98.1%，检测灵敏度下限为8.3×101 copies/µl，在线性范围内具有良好的组内和组间重复性。对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍。利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA (HpDNA)中的EHP SSU rDNA进行了qPCR检测，结果显示，EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系，肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng HpDNA)时代表了较高的风险水平。本研究建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点，所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考。
根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) SSU rDNA序列设计1对特异性引物，建立并优化了EHP的SYBR Green I实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法。结果显示，该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好，产物的熔解曲线为1个单峰，构建的方法对8.3×101–8.3×108 copies/µl的EHP SSU rDNA片段的检测响应具有良好的线性关系，扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=–3.369 log(Sq)+39.364 (R2=0.992)，扩增效率为98.1%，检测灵敏度下限为8.3×101 copies/µl，在线性范围内具有良好的组内和组间重复性。对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍。利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA (HpDNA)中的EHP SSU rDNA进行了qPCR检测，结果显示，EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系，肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng HpDNA)时代表了较高的风险水平。本研究建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点，所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考。
