微卫星DNA，又称简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)或短串联重复序列(Short Tandem Repeats, STR)，通常指基因组上1–6个核苷酸为重复单位组成的DNA序列(Toth et al, 2000)。微卫星标记因多态性丰富、杂合度高、稳定性好、共显性遗传及符合孟德尔定律等优点，而被广泛用于种群遗传多样性研究、物种起源与进化分析、基因定型、指纹鉴定、遗传图谱构建与家系分析等。因此，分析物种的基因组微卫星的碱基组成、含量、分布特征，有助于从进化角度了解各物种内各重复类型的分布特点及其生物学功能(Gao et al, 2005; Katti et al, 2001; Prasad et al, 2005; Li et al, 2005; 郭文久, 2004¹⁾)。迄今为止，已报道的基因组微卫星特征分析有30多个物种，包括人类和黑猩猩在内的灵长类、小鼠、家猪、鸡、蚊子、海鞘、斑马鱼及中国对虾等动物，也有拟南芥、水稻和小麦等植物和一些原核生物(郭文久, 2004¹⁾; Li et al, 2004; Gao et al, 2005)。研究结果表明，在真核生物基因组中，二核苷酸微卫星序列最为丰富(Ma et al, 1996)，但不同物种的微卫星序列含量各不相同(Wang et al, 1994)。目前，水生生物基因组微卫星特征分析多局限于单一物种，即分类学的“种”级水平，如三疣梭子蟹(宋来鹏等, 2008)、日本囊对虾(栾生等, 2007)、牙鲆(王蕾等, 2009)、红鳍东方鲀(崔建洲等, 2006)、中国对虾(高焕等, 2004)等，但在分类学的“科”级水平上分析基因组微卫星的分布特征鲜见报道。在“科”级水平上研究其微卫星序列特征，可加深了解科内其他物种基因组微卫星序列的分布规律，提高微卫星标记的开发和应用效率。随着水生生物基因组大规模测序工作的开展，微卫星标记的开发与应用研究将获得更新、更准确并且具有普遍意义的结果。

1)郭文久.微卫星在基因组上的分布与功能及其计算方法初步研究.四川农业大学博士研究生学位论文, 2004, 1–163

虾虎鱼科鱼类分布广泛、种类纷繁、分类复杂，共有242属，2000种之多，是鱼类中最大的科(李思忠等, 1994)。据统计，我国虾虎鱼类约84属269种(伍汉霖等, 2008)。虾虎鱼在水生种质资源中具有重要地位，少数虾虎鱼类，如矛尾复虾虎鱼(Synechogobius hasta)、大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)等为经济鱼类，其余大部分为大型鱼类饵料，其中，部分虾虎鱼属于观赏鱼类，例如短虾虎属(Brachygobius)的种类等。

近年来，由于水生生物种质资源的不断衰退，对虾虎鱼类的种质资源保护和开发利用也备受关注。在基因组水平上研究虾虎鱼科鱼类微卫星重复序列的分布特征，能够深化认知虾虎鱼科鱼类基因组遗传结构特征，将为虾虎鱼科鱼类微卫星标记的开发与应用提供参考。

2011年4月在北黄海采集矛尾复虾虎鱼48尾，剪鳍条，用无水乙醇固定，4℃保存备用。对上述样品进行微卫星自主开发，获得矛尾复虾虎鱼微卫星序列153条，含有68个微卫星位点和85个小卫星位点(Bai et al, 2012)。同时，从GenBank中筛选出虾虎鱼科微卫星序列533条，含有405个微卫星位点和128个小卫星位点。本研究所分析的虾虎鱼科基因组微卫星序列合计686条，共含有473个微卫星位点，分别隶属于16属19种(表 1)。

表 1(Tab. 1)

表 1 虾虎鱼科微卫星序列信息 Table 1 The SSR information of species of the Gobiidae family 种名 Species 序列数(微卫星数) Sequences (SSR loci) GenBank序列号 GenBank No. 矛尾复虾虎鱼Synechogobius hasta     153(68) 本研究，in this study 矛尾复虾虎鱼Synechogobius hasta     76(69) EU714684-EU714759 双须多棘虾虎鱼Sufflogobius bibarbatuis     15(14) JN251023-JN251036 彼氏冰虾虎鱼Leucopsarion petersi     97(31) AB662996-AB663083 AB304787-AB304796 关岛阿胡虾虎鱼Awaous guamensis     14(12) HQ393961-HQ393975 大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris     150(130) HQ852252-HQ852395 FJ598061-FJ598069 黑口新虾虎鱼Neogobius melanostomus     16(11) DQ9999744-DQ999981 EU732735-EU732744 大头新虾虎鱼Neogobius kessleri     19(15) EF629921-EF629939 尾纹裸头虾虎鱼Chaenogobius annularis     16(13) AB557720-AB557736 环肛鲯塘鳢虾虎鱼Coryphoterus peraonatus     17(12) GQ428991-GQ428998 AY738124-AY738132 白带高鳍虾虎鱼Pterogbius zonoleucus     11 (6) AB447471-AB447481 黄体尻虾虎鱼Gobius culus flavescens     8(4) EU295520-EU295527 青弹涂鱼Scartelaos histophorus     14(21) HQ128584-HQ128597 丝棘栉眼虾虎鱼Ctenogobius feroculus     18(10) EF115293-EF115298 DQ402141-EF402152 高伦颌鳞虾虎鱼Gnatholepis callerensis     7(6) EF115288-EF115294 蛇头虾虎鱼Zostrisessor ophiocephalus     12(11) AY687320-AY687331 菊花吻虾虎鱼Rhinogobius sp.     11(10) AB159090-AB159099 云斑长臀虾虎鱼Pomatoschistus marmoratus     3(3) DQ334750-DQ334752 小长臀虾虎鱼 Pomatoschistus minutus     24(22) AF516891-AF516903 DQ914817-DQ914827 小眼长臀虾虎鱼Pomatoschistus micropos     5(5) DQ334751-DQ334754

表 1 虾虎鱼科微卫星序列信息 Table 1 The SSR information of species of the Gobiidae family

利用软件Tandem Repeats Finder (Version 3.21) (Sugaya et al, 2002)进行微卫星查找分析。微卫星序列的最小长度为12 bp (郭文久, 2004)¹⁾，即单碱基重复序列必须达到12个或12个拷贝以上，而六碱基重复仅需2个或2个拷贝以上即可。对查找到的微卫星序列进行统计分析，根据碱基互补配对原则和阅读起始碱基顺序的差异，对每种长度类型的重复单位基序进行同类兼并(表 2)。1–3碱基重复可以兼并为表 2中的几种类型，4碱基及其以上重复的兼并原则与表 2中相同，1–6碱基重复兼并后的重复类型数目分别为2、4、10、33、102、350。

表 2(Tab. 2)

表 2 虾虎鱼科鱼类微卫星碱基重复类型 Table 2 The types of SSR repeats of species of the Gobiidae family 重复碱基类型Types of repeat sequence 对应碱基种类Types of nucleotide corresponding to repeat sequence     二碱基重复Dinucleotide repeat     AT     AT、TA          AG     AG、GA、TC、CT          AC     AC、CA、TG、GT          GC     GC、CG     三碱基重复Trinucleotide repeat     AAT     AAT、ATA、TAA、TTA、TAT、ATT          AAC     AAC、ACA、CAA、TTG、TGT、GTT          AAG     AAG、AGA、GAA、TTC、TCT、CTT          ATC     ATC、TCA、CAT、TAG、AGT、GTA          ACG     ACG、CGA、GAC、TGC、GCT、CTG          ACT     ACT、CTA、TAC、TGA、GAT、ATG          AGC     AGC、GCA、CAG、TCG、CGT、GTC          GCC     GCC、CCG、CGC、CGG、GGC、GCG          AGG     AGG、GGA、GAG、TCC、CCT、CTC          ACC     ACC、CCA、CAC、TGG、GGT、GTG

表 2 虾虎鱼科鱼类微卫星碱基重复类型 Table 2 The types of SSR repeats of species of the Gobiidae family

1)郭文久.微卫星在基因组上的分布与功能及其计算方法初步研究.四川农业大学博士研究生学位论文, 2004, 1–163

为了衡量微卫星重复类型变异能力的大小，根据栾生等(2007)引入变异系数概念，变异系数的计算公式为:

式中，S为某类型重复序列拷贝数的标准差，x为拷贝数的平均值。变异系数可以消除单位和(或)平均数不同对2个或多个资料变异程度比较的影响，能够真实地反映重复类型变异水平的高低，便于进行类型间的比较(栾生等, 2007)。

通过对19种虾虎鱼科鱼类已知微卫星序列进行分析，结果从中筛选出虾虎鱼科微卫星序列686条，序列总长度为295062 bp，其中含有473个微卫星位点，微卫星位点累计长度为33370 bp。

由表 3可以看出，在686条微卫星重复序列中，共473个微卫星位点。在各重复类型中以二碱基重复最多(361个)，占总微卫星位点的76.32%，其中重复拷贝类别最多的是AC重复(340个)，占二碱基重复微卫星的94.18%，没有发现AT和GC两种重复类型；其次是四碱基重复(68个)，占总微卫星的14.38%，在四碱基重复类型中以CTAT重复最多(31个)，占四碱基重复微卫星的45.56%；第三类是三碱基重复类型(35个)，占总微卫星的7.40%，在三碱基重复中以ACT占的比例最多，占三碱基重复微卫星的34.29%；第四类是六碱基重复类型，占全部微卫星的1.48%；第五类是五碱基重复类型，其中只有TCTGG和ATCTA两种类型，只占全部微卫星的0.42%；在所有碱基重复类型中没有发现单核苷酸重复类型。重复序列长度作为衡量标准得到的结果与此类似，其中，二碱基重复类型占微卫星序列累计长度的79.60%，其次，四碱基重复占微卫星序列累计长度的13.42%。

表 3(Tab. 3)

表 3 微卫星重复类型的频率和分布 Table 3 The frequency and distribution of SSR of species of the Gobiidae family 重复类型 Repeat type SSR数 SSR number 占SSR 总数比 Ratio(%) 累计 长度 Total length 占SSR序列 总长比 Length ratio of SSR(%) 占重复序列 总长比 Length ratio of repeat(%) 拷贝数 Copy number 平均 拷贝数 Mean copy 拷贝数 变异系数 Coefficient of variation (%) 平均GC含量 Mean GC content AG 21 4.44 1212 3.63 0.41 14.0-104.0 28.86 76.51 0.50 AC 340 71.88 25351 75.97 8.59 13.0-234.0 37.28 67.59 0.50 Subtotal 361 76.32 26563 79.60 9.00 13.0-234.0 36.79 0.50 AAT 3 0.63 119 0.36 0.04 9.0-16.3 13.22 23.30 0.00 AAC 3 0.63 129 0.39 0.04 13.0-16.3 14.33 9.91 0.34 AAG 4 0.85 192 0.58 0.07 9.3-23.0 16.00 30.52 0.39 ATC 8 1.69 435 1.30 0.15 10.7-29.0 18.13 37.35 0.35 ACG 2 0.42 86 0.26 0.03 13.7-15.0 14.33 4.54 0.68 ACT 12 2.54 692 2.07 0.23 9.3-33.7 19.22 41.56 0.34 AGC 1 0.21 26 0.08 0.01 8.7-8.7 8.67 0 0.66 AGG 2 0.42 75 0.22 0.03 10.3-14.7 12.50 17.60 0.65 Subtotal 35 7.40 1754 5.26 0.59 9.0-33.7 25.06 0.52 CTAT 31 6.55 2462 7.38 0.83 3.25-60.0 19.85 62.15 0.27 ACAT 4 0.85 202 0.61 0.07 7.8-18.0 12.63 34.71 0.26 CATC 13 2.75 594 1.78 0.20 6.25-32.0 11.42 64.03 0.48 AAAC 3 0.63 142 0.43 0.05 7.0-20.0 11.83 49.09 0.26 CTAT 2 0.42 167 0.50 0.06 16.8-25.0 20.90 19.62 0.25 GTGC 3 0.63 142 0.43 0.05 10.8-13.0 11.83 7.62 0.77 GAAG 1 0.21 47 0.14 0.02 11.8-11.8 11.75 0 0.48 TCTG 6 1.27 322 0.96 0.11 7.0-22.0 13.42 43.08 0.49 ACAC 3 0.63 318 0.95 0.11 22.0-33.3 26.50 18.40 0.60 GTCA 1 0.21 35 0.10 0.01 8.75-8.75 8.75 0 0.52 TCTT 1 0.21 48 0.14 0.02 12.0-12.0 12.00 0 0.25 Subtotal 68 14.38 4479 13.42 1.52 3.25-33.3 16.47 0.37 TCTGG 1 0.21 53 0.16 0.02 10.6-10.6 10.60 0 0.55 ATCTA 1 0.21 25 0.07 0.01 5.0-5.0 5.00 0 0.20 Subtotal 2 0.42 78 0.23 0.03 5.0-10.6 7.80 0.38 TGCGTG 1 0.21 86 0.26 0.03 14.3-14.3 14.33 0 0.65 TAGGGC 1 0.21 51 0.15 0.02 8.5-8.5 8.50 0 0.55 GGTCCT 1 0.21 40 0.12 0.01 6.7-6.7 6.67 0 0.68 GGTCTT 2 0.42 197 0.59 0.07 5.8-27.0 16.42 68.30 0.55 AATACA 1 0.21 34 0.10 0.01 5.7-5.7 5.67 0 0.12 ACACAC 1 0.21 88 0.26 0.03 14.7-14.7 14.67 0 0.58 Subtotal 7 1.48 652 1.95 0.22 5.0-27.0 15.52 0.53 Total 473 1 33370 1 11.36

表 3 微卫星重复类型的频率和分布 Table 3 The frequency and distribution of SSR of species of the Gobiidae family

重复单位拷贝数变异能力分析显示(表 3)，二核苷酸重复中变异能力最大的是AG重复类型(76.51%)，其次是AC重复类型(67.59%)；三核苷酸重复中变异能力最大的是ACT重复类型(41.56%)；四核苷酸重复中变异能力最大的是CATC重复类型(64.03%)；五核苷酸的各类型变异系数均为0；六核苷酸重复中变异能力最大的是GGTCTT重复类型。

1)郭文久.微卫星在基因组上的分布与功能及其计算方法初步研究.四川农业大学博士研究生学位论文, 2004, 1–163

统计学发现，在6种重复类型中，拷贝数变化范围从3.3–234.0不等，主要分布在15–60之间，占总微卫星位点数的76.96%。与拷贝数的分布趋势相对应，微卫星序列的长度主要分布在30–80个碱基的范围内。重复单位拷贝数范围以两核苷酸重复拷贝数最广，在13.0–234.0之间，其中，主要分布在10–50之间(293个)，占总微卫星位点数的81.16%；其次是四碱基重复类型，在3.25–33.25之间，主要分布在5.0–25.0之间(56个)，占总微卫星位点数的82.35%；三碱基重复类型分布在9.0–33.7之间；六碱基重复类型分布在5.0–27.0之间；以五碱基重复类型分布范围最窄，在5.0–10.6之间。5种长度重复单位类型微卫星平均拷贝数分别为36.79、25.06、16.47、7.80、15.52，其中，以两核苷酸重复类型的平均拷贝数最高，五核苷酸重复类型的平均拷贝数最低。

单碱基重复是微卫星的一种重要类型，不同物种间差异极大，如中国对虾的单碱基重复占总微卫星数的3.67%，红鳍东方鲀的单碱基重复占总微卫星数的0.81%，而本研究所分析的686条虾虎鱼科微卫星序列中未发现单碱基重复类型，除了分析过程软件设置的参数较严格以外，还可能与虾虎鱼科的物种特异性有关。

本研究只发现了AC和AG两种二碱基重复类型，未发现AT和GC重复类型。与其他海洋生物微卫星特征相比较，虾虎鱼科与(孙典巧等, 2011)和红鳍东方鲀(崔建洲等, 2006)的微卫星重复类型相似，即AC含量最丰富；而中国明对虾和日本囊对虾的AT重复拷贝最丰富(栾生等, 2007; 高焕等, 2004)，三疣梭子蟹的AG重复拷贝最丰富(宋来鹏等, 2008)。另外，与这些物种的相同点为微卫星重复类别中均缺少GC重复。Schoreeret等(1992)推测，GC含量稀少的根本原因是：基因组DNA CpG的甲基化使得胞苷酸(C)很容易经过脱氨基作用转变成胸腺嘧啶(T)，而少量的GC又是维持DNA热力学稳定性所必需的，这样就使GC重复减少，同时突变后的序列TG(即AC类型)相应增加，这同样可以在一定程度解释虾虎鱼科微卫星重复类型中AC含量最多的现象。

虾虎鱼科微卫星序列的三碱基重复类型共出现了8种，以ACT重复类型所占比例最多，其次是ATC类型；没有发现GCC和ACC两种重复类型。与其他水生生物微卫星特征相比较发现，三疣梭子蟹的三碱基重复也是以ACT重复类型出现次数最多(宋来鹏等, 2008)；而日本囊对虾(高焕等, 2004)和红鳍东方鲀(崔建洲等, 2006)则以AAT重复类型最多。Pearson等(1998)报道，在所有的微卫星重复类型中，三碱基重复微卫星最为特殊，一些三碱基重复与某些遗传性病变密切相关，而通过改变相关基因的表达则有望控制某些遗传疾病的发生(Cummings et al, 2000)。

在虾虎鱼科微卫星重复序列的四碱基重复类型中，共出现了11种微卫星重复类型。其中，CTAT出现次数最多，共31个，其次是CATC，共13个，这2种重复类型占四碱基重复类型的64.7%。据报道，AAAX (AAAT、AAAC、AAAG)在灵长类和啮齿类中最丰富(Li et al, 2005)，在鱼中，AAAC在四核苷酸的重复序列中出现的频率也最高，而在虾虎鱼科鱼类中该类型重复并不丰富，仅出现3次。在红鳍东方鲀和日本囊对虾中，均以AGAT重复出现的频率最高(崔建洲等, 2006; 高焕等, 2004)。

虾虎鱼科微卫星的五碱基重复类型出现的种类和数量均较少，在整个微卫星重复类型中只出现了2个重复，这与红鳍东方鲀基因组中五碱基重复类型的微卫星数量也较少的情况类似。五碱基重复类型的微卫星的生物学意义报道的不多，De Fonzo等(1998)发现五碱基重复可能与一些人类疾病相关。

在虾虎鱼科微卫星重复序列中，六碱基重复类型共发现6种重复类型，其中只有GGTCTT出现2次，其他每种重复类型均各出现1次，并且各种重复拷贝类别的拷贝数均较少。对六碱基重复及其生物学意义的研究比较少，还有待进一步研究。

变异系数用来衡量观测值变异程度，变异系数越大，该重复类型的变异水平就越高(Larmuseau et al, 2007)。由表 3可以看出，变异系数最大的是AG重复类型(76.51%)，其次是GGTCTT重复类型(68.3%)，因此，变异能力与碱基重复单位数量并无相关性，而较长重复单位的类型有较大的变异能力。在所有的微卫星重复类型中，二核苷酸重复类型的平均变异系数最高，而五核苷酸重复类型的变异系数最小，说明二核苷酸重复类型是基因组微卫星中最活跃的类型。分析结果表明，拷贝数分布范围越广，变异系数越大，即变异系数与拷贝数分布范围正相关。

虾虎鱼种类多、分布广，是经过长期进化和生存竞争保留下来的重要海洋鱼类，与其他物种共同组成了有机生命链。刘群等(1997)认为，渤海存在2条主要食物链，其中一条是多毛类、虾、蟹通过虾虎鱼等小型鱼类转为石首鱼科等底层鱼类的食物。虾虎鱼类正处于底栖食物链的中继地位，具有重要的生态学意义。如黄鳍刺虾虎鱼(Acanthogobius flavimanus)广泛分布在黄渤海沿岸软泥或砂泥底质的河口区，是莱州湾的重要虾虎鱼类，在食物链中，它既是下一级经济仔稚鱼和虾蟹类幼体的捕食者，又是上一级多种经济鱼类的重要饵料，在整个生态系统中占据重要地位(龚艳丽等, 2000)。因此，虾虎鱼作为生态系统的重要组成部分，了解其物种多样性以及群体遗传学特性将会有重要的生态学意义。

虽然虾虎鱼种类繁多，但仅在少数几种虾虎鱼中有微卫星分离的报道(Mendonca et al, 2001; Martina et al, 2007; Dufour et al, 2007; Hepburn et al, 2005)，虾虎鱼“科”级水平微卫星的特征分布均不清楚，因此，对虾虎鱼类微卫星还有待进一步的研究。本研究发现，虾虎鱼科微卫星在总微卫星重复序列中占绝对优势的二碱基重复拷贝数主要分布在10–50之间，即虾虎鱼基因组中的微卫星长度主要分布在20–100个碱基的长度范围内，说明在长期进化中微卫星位点积累的变异相对较大，因而，预测这些微卫星序列具有丰富的多态信息，为下一步优化和筛选特异性微卫星标记奠定了基础。