虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)是一种冷水性贝类，原产于日本北海道、俄罗斯千岛群岛南部等水域，是品质优良的增养殖扇贝品种之一。自20世纪80年代引入我国后，经过30多年的发展，虾夷扇贝已经成为我国重要的海水经济养殖贝类，在黄海北部以及山东长岛等地形成了规模化的繁育及增养殖产业，与海湾扇贝(Argopecten irradias)、栉孔扇贝(Chlamys farrerii)共同构成了我国北方沿海主要的扇贝养殖品种(王庆成, 1984; Li et al, 2007; 常亚青等, 2007; 李成林等, 2011)。然而，近些年，虾夷扇贝大规模死亡在其主产区时常发生，尤其在夏季高温季节，死亡率有时甚至超过80%，给虾夷扇贝产业的健康发展带来了巨大威胁(张明明等, 2008; 徐东等, 2010)。养殖密度大、种质下降、病原侵染等都可能是造成大规模死亡的重要原因，但毋庸置疑，夏季水温的升高是虾夷扇贝死亡事件发生的直接诱因之一(蓝淑芳, 1990; 周玮等, 1992)。虾夷扇贝属于冷水性的变温动物，其最适宜生长温度为10–20℃，低于0℃或超过23℃时，活力便减弱，生理状态受到影响(刘世禄等, 2005)，其适应温度骤然变化的能力不强。因此，海水温度不仅显著影响其生长、繁殖等生理特性，还限制了养殖地域范围。为提高虾夷扇贝耐高温抗逆能力，减少夏季死亡率，已有针对其耐热性状进行相关筛选、高温对机体生理影响等方面的研究报道(徐东等, 2010; 王庆志等, 2014)，这将有助于新品种(系)的开发，对虾夷扇贝产业的健康发展具有重要意义。

DNA甲基化作为表观遗传学的重要研究内容，具有调控基因的表达、维持基因组遗传物质的稳定性、建立表观遗传模式等重要功能。在逆境胁迫下，甲基基团能够迅速、可逆地对DNA进行修饰，避免了不必要的基因重组，从而更加快速地响应环境的变化(Boyko et al, 2008)。研究表明，生物和非生物胁迫都能够引起植物DNA甲基化的改变，而且某些甲基化的改变能够遗传给后代。如，烟草(Nicotiana tabacum)基因组大约10%的位点在非生物胁迫下发生低甲基化，人工接种烟草花叶病毒(TMV)后，随着过敏性反应(HR)的发展，病原菌应答基因NtA lix 1和NtGP DL的DNA甲基化迅速响应(1–24 h)，且呈现动态变化的特点，基因表达量也发生改变(Wada et al, 2004; Choi et al, 2007)，表明研究环境胁迫对基因组DNA甲基化的影响对于挖掘抗逆基因、开展抗逆新品种(系)培育具有重要意义。然而，相对于植物，水产动物DNA甲基化对胁迫响应的报道相对较少，主要集中于尼罗罗非鱼(Orecochromis niloticus)耐寒品系(朱华平等, 2013)、鲫鱼(Carassius auratus)(周新文等, 2001)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)(王丙莲等, 2006)等为数不多的一些物种，研究内容也尚处于研究基因组DNA甲基化水平上。虽然在海洋贝类中已有基因组DNA甲基化的相关报道，但其对环境胁迫的响应研究十分匮乏。

本研究运用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析急性温度胁迫对虾夷扇贝基因组DNA甲基化水平和模式的影响，初步探讨其机体应对胁迫的表观响应，研究能够为培育虾夷扇贝抗逆新品种(系)提供参考数据，将丰富海洋贝类表观遗传学研究资料。

实验用虾夷扇贝取自山东长岛海区，平均壳长为(6.7±0.2) cm。扇贝运回实验室后，在9℃的海水中充气暂养，期间投喂硅藻、金藻等单胞藻。暂养7 d，待扇贝完全适应实验室环境后，进行温度胁迫实验。胁迫温度设置2个梯度，即17℃和24℃，分别胁迫9 h、24 h后，取鳃组织，置于液氮速冻后，保存于–80℃中备用。将17℃处理9 h的组别记为A₁组，17℃处理24 h记为A₂组，24℃处理9 h记为B₁组，24℃处理24 h记为B₂组，正常9℃为对照组，记为C组。

以上述所取的扇贝鳃丝为材料，采用传统的酚-氯仿法进行基因组DNA提取，具体步骤如下：取组织约100 mg，用剪刀剪碎后置于475 μl的TE裂解液中加入40 μl 10% SDS和5 μl蛋白酶K(20 mg/ml)，在56℃水浴中处理3 h左右使组织充分消化，然后依次用25:24:1的酚-氯仿-异戊醇混合液抽提2次，1/10体积的NaCl (3 mol/L)及2倍体积的无水乙醇沉淀30 min，70%乙醇洗涤后在生物安全柜中风干，TE溶解沉淀。所提取的基因组DNA经1.5%琼脂糖电泳检测其完整性，OD_{260 nm/280 nm}检测纯度，调整DNA浓度至300 ng/μl，存于–20℃中备用。

每组选择6个个体进行MSAP实验，具体参照吴彪等(2012)的方法。其原理是基于MspⅠ和HpaⅡ均能识别CCGG位点，但由于敏感性不同而产生差异条带。首先，运用EcoR I/Msp I(M组)和EcoRⅠ/HpaⅡ(H组)分别对每个个体基因组DNA进行双酶切，体系：1 μl DNA(300 ng/μl)，5 U EcoRⅠ (TaKaRa)，5 U HpaⅡ/MspⅠ(TaKaRa)，2 μl 10×Buffer (TaKaRa)，灭菌ddH₂O加至20 μl。依次在37℃水浴中酶切4 h、65℃变性10 min后，储存于–20℃中。之后进行连接，体系：5 μl酶切产物，50 pmol HM接头，10 pmol E接头，5 U T₄ DNA Ligase (TaKaRa)，4 μl 5× T₄ DNA Ligase Buffer，补水至20 μl，16℃连接过夜，产物稀释10倍后用于预扩增。

预扩增反应体系：2 μl连接产物，2 μl预扩引物E₀和HM₀，0.5 U Taq酶，2 μl 10× Taq buffer(含Mg²⁺)，1.6 μl dNTPs(各2.5 mmol/L)，补水至20 μl。PCR扩增反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，20个循环；最后72℃延伸10 min。预扩增产物稀释20倍后作为选择扩增的模板。

选扩体系：3 μl预扩增产物，2 μl HM_n引物，0.5 μl E_n引物，其他反应组分与预扩体系相同。PCR反应程序：94℃预变性3 min；第1轮扩增13个循环，94℃变性30 s，65℃退火1 min (每循环降低0.7℃)，72℃延伸1 min；第2轮扩增25个循环，包括94℃变性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min。运用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR产物进行电泳，银染检测。本研究所用的引物信息见表 1。

表 1(Tab. 1)

表 1 本研究所用的接头以及引物序列 Table 1 Sequences of adapters and primers used in this study EcoRⅠ MspⅠ/ HpaⅡ 接头Adapters(5’-3’) EA1：CTCGTAGACTGCGTACC EA2：AATTGGTACGCAGTCTAC HMA1：GATCATGAGTCCTGCT HMA2：CGA GCA GGA CTC AGA A 预扩引物Pre-amplification primers(5’-3’) E0：GACTGCGTACCAATTC HM0：ATCATGAGTCCTGCTCGGG 选扩引物 Selective amplification primers(5’-3’) E1：GACTGCGTACCAATTCACA E2：GACTGCGTACCAATTCAGT E3：GACTGCGTACCAATTCAAC E4：GACTGCGTACCAATTCGTC E5：GACTGCGTACCAATTCAGCT HM1：ATCATGAGTCCTGCTCGGGCTGA HM2：ATCATGAGTCCTGCTCGGGCTGT HM3：ATCATGAGTCCTGCTCGGGCTAT HM4：ATCATGAGTCCTGCTCGGGCTAC HM5：ATCATGAGTCCTGCTCGGGCTCA HM6：ATCATGAGTCCTGCTCGGGCTCT HM7：ATCATGAGTCCTGCTCGGGCTTC HM8：ATCATGAGTCCTGCTCGGGCTTA

表 1 本研究所用的接头以及引物序列 Table 1 Sequences of adapters and primers used in this study

对HM_n和E_n引物组合进行筛选后，选择扩增条带清晰、多态性好的引物用于实验分析。统计PAGE电泳图上每个个体M组和H组中50–200 bp的扩增条带，有带记为1，无带记为0。计算各群体的平均总甲基化率：

平均总甲基化率=(全甲基化位点+半甲基化位点)/(未甲基化位点+全甲基化位点+半甲基化位点)×100%

运用SPSS软件对各群体总甲基化率进行多重比较。

以对照组扇贝群体的混合基因组DNA为模板，通过酶切、连接反应后，用表 1中的预扩和选扩引物依次进行PCR扩增，扩增产物通过6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，在E_1–5和HM_1–8的40对引物组合中筛选获得引物，选用E₁HM₄、E₁HM₅、E₃HM₅、E₃HM₆、E₄HM₅、E₄HM₈、E₅HM₆、E₅HM₇、E₅HM₈等9对引物用于分析急性温度胁迫对虾夷扇贝基因组DNA甲基化的影响。

根据MSAP原理，由于MspⅠ和HpaⅡ对CCGG位点甲基化的敏感性差异，从而H组和M组对同一CCGG位点会产生不同的酶切效果，其扩增产物在丙烯酰胺电泳图上会出现不同的条带类型。HpaⅡ对双链内部C碱基的全甲基化敏感，不能切开双链内部C碱基全甲基化的位点，但对任意一条单链外部C碱基甲基化不敏感，所以能够有效切开外部C碱基的半甲基化位点；而MspⅠ能够切开内部甲基化位点(^HMeCG或^MeCG)；2种酶均不能有效切开外部C碱基的全甲基化(^MeCCG)或内外C碱基的全甲基化(^MeC^MeCG)、全半甲基化(^HMeC^HMeCG)的位点。所以，每个样品H组和M组在同一个CCGG位点上的扩增产物不同，根据MSAP凝胶电泳图谱上条带的有无，2个泳道上的同一位点会出现3种模式：(Ⅰ) H组和M组的泳道中均有条带(1, 1)，表示该位点去甲基化；(Ⅱ) 2泳道中H组中有条带，M组中没有条带(1, 0)，表示该位点半甲基化；(Ⅲ) 2泳道中H组中没有条带，M组中有条带(0, 1)，表示该位点全甲基化。结果显示，各组虾夷扇贝基因组DNA均具有上述3种甲基化模式。不同DNA甲基化模式的扩增条带如图 1所示。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同引物组合在虾夷扇贝基因组DNA中的MSAP扩增图谱 Figure 1 DNA methylation profile of P. yessoensis using different primer pairs H： EcoRⅠ/Hpa Ⅱ酶切产物泳道；M： EcoRⅠ/MspⅠ酶切产物泳道A：去甲基化位点；B：半甲基化位点；C：全甲基化位点 H: PCR products of enzymatic digestion by EcoRⅠ and HpaⅡ, M: PCR products of enzymatic digestion by EcoR I and Msp I; A: Unmethylated, B: Hemi-methylated, C: Fully-methylated

对各组虾夷扇贝基因组DNA在MSAP电泳图上的扩增条带进行统计并对各组总甲基化率进行了多重比较，结果见表 2和表 3。结果显示，对照组C和A₁、A₂、B₁、B₂的扩增位点分别为326和337、314、331、337，各组均以非甲基化位点为主，总甲基化位点分别为93和94、83、84、79，每个群体的平均总甲基化率分别约为28.51%和28.2%、26.43%、25.38%、23.45%。与对照组相比，只有B₂组的总甲基化率存在显著差异(P < 0.05)，其他组差异均未达到显著水平(P > 0.05)。但虾夷扇贝基因组DNA甲基化水平在温度胁迫下有明显的规律性变化。可以看出，急性升温胁迫能够使虾夷扇贝基因组DNA总甲基化率下降，所有处理组均小于对照组，有明显的去甲基化趋势。而且，在相同的处理时间下，温差增加总甲基化率降低(A₁＞B₁，A₂＞B₂)，而在相同温差刺激条件下，处理时间增长，总甲基化下降(A₁＞A₂，B₁＞B₂)。

表 2(Tab. 2)

表 2 不同温度处理条件下的虾夷扇贝基因组DNA甲基化水平 Table 2 The genomic DNA methylation of P. yessoensis under different temperatures 组别 Groups 总扩增位点 Total amplified sites 非甲基化位点 Non-methylated sites 甲基化位点Methylated sites 总甲基化率 Total methylation rate(%) (Mean±SD) 总甲基化位点 Total methylated sites 全甲基化位点 Fully-methylated sites 半甲基化位点 Hemi-methylated sites A1 337 243 94 46 48 28.20±2.10 A2 314 231 83 55 28 26.43±1.41 B1 331 247 84 30 54 25.38±0.92 B2 337 258 79 43 36 23.45±0.88 C 326 233 93 28 65 28.51±1.80

表 2 不同温度处理条件下的虾夷扇贝基因组DNA甲基化水平 Table 2 The genomic DNA methylation of P. yessoensis under different temperatures

表 3(Tab. 3)

表 3 不同组别虾夷扇贝基因组DNA总甲基化率的多重比较 Table 3 Multiple comparisons of total methylation rate among different groups of P. yessoensis 组别Groups A1 A2 B1 B2 C A1 — 0.0177 0.0282 0.0475* –0.0031 A2 — 0.0105 0.0298 –0.0208 B1 — 0.0193 –0.0313 B2 — –0.0506* C — *:差异显著(P < 0.05) *: significant difference

表 3 不同组别虾夷扇贝基因组DNA总甲基化率的多重比较 Table 3 Multiple comparisons of total methylation rate among different groups of P. yessoensis

DNA甲基化是指甲基化基团在甲基转移酶的催化作用下被添加到DNA分子中的胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶，是一种重要的表观修饰方式。目前，进行DNA甲基化检测主要有检测基因组整体水平的甲基化、特异位点甲基化以及寻找新甲基化位点3个主要目的，所用的检测方法主要有甲基化敏感扩增多态性(MSAP)、重亚硫酸盐测序法和芯片技术等。其中，MSAP是在扩增片段长度多态性(AFLP)技术上发展而来的，具有较好的有效性和可靠性，是目前研究基因组DNA甲基化整体水平的成熟方法之一(Xiong et al, 1999; Yaish et al, 2014)。相对而言，MSAP具有操作简单、敏感性强、成本低等优点，已广泛应用在动植物育种、杂交优势分析等方面的研究中，但在水产领域中的应用起步较晚。已有的报道表明，MSAP也能够较好地应用于鱼(周新文等, 2001; Fang et al, 2013)、虾(杜盈等, 2013)、贝(于涛等, 2010; 吴彪等, 2012; Sun et al, 2014; 姜群等, 2014)、海参(郭婷婷等, 2013)等多种重要水产经济动物的基因组DNA甲基化的分析中。目前，研究主要集中在对水产动物不同群体和不同组织DNA甲基化水平的研究上。随着技术的不断发展，MSAP在贝类上的研究报道也越来越多，在栉孔扇贝、杂交扇贝、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)等相关研究中都证实了MSAP应用在贝类上的可行性和可靠性。本研究通过筛选引物组合，选用了扩增稳定、多态性好的9对引物组合，证实MSAP能够较好地应用于虾夷扇贝基因组DNA甲基化的研究中。姜群等(2014)对MASP技术进行了改进，在原技术基础上对选择性引物进行荧光标记，采用测序仪检测荧光信号后利用软件将峰图转化为数据，大大提高了检测灵敏度，高效地完成了太平洋牡蛎不同组织DNA甲基化的检测，充分显示了该技术在贝类分析中的广阔应用前景。

本研究选用虾夷扇贝鳃丝组织作为研究对象，统计获得各组基因组DNA总甲基化率的范围为23.45%– 28.51%，与已报道的栉孔扇贝(20.9%–21.7%、32.08%) (吕佳等, 2013; Sun et al, 2014)、海湾扇贝(25.99%) (吕佳等, 2013)、太平洋牡蛎(26.4%) (Jiang et al, 2013)、虾夷扇贝(32.88%–32.97%) (吕佳等, 2013)、杂交扇贝(18.7%–22.7%) (吴彪等, 2012)等多种贝类的数据相近。取样部位、材料来源、检测方法、统计所选用的引物及统计范围等都可能造成总体甲基化率的差异，如使用灵敏度更高的手段检测太平洋牡蛎MSAP分析结果时，总甲基化率提高了8% (Jiang et al, 2013; 姜群等, 2014)。虽然不同学者的研究结果存在一定的差异，但这些数据为初步了解贝类基因组DNA甲基化状况和进一步深入相关研究奠定了基础。

DNA甲基化与基因表达密切相关，大量的研究表明，外界环境的变化能够引起基因组DNA甲基化状态的改变(Steward et al, 2002; 王丙莲等, 2006; 钟兰等, 2007; 潘雅姣等, 2009)，从而调控基因表达以快速适应环境。虾夷扇贝是一种冷水性的贝类，对高温耐受能力差，最高正常成活水温为23.8℃(陈舜等, 2007)，15–22℃之间温度升高能够显著改变T-AOC、MDA和CAT的活力(贲月等, 2013)，而且温度剧烈和缓慢变化都能够引起虾夷扇贝耗氧率和排氨率变化(徐东等, 2010)，更高的水温甚至可能会引起虾夷扇贝的大量死亡。可见，温度变化对虾夷扇贝机体生理状态变化具有显著影响，但目前有关温度对贝类基因组DNA甲基化影响的研究尚未有报道。本研究发现，所有处理组总甲基化率均低于对照组，说明急性温度胁迫使虾夷扇贝基因组DNA总甲基化下降，去甲基化现象明显。而且，在本实验条件下，总甲基化水平随温差、处理时间的增加而下降，甲基化模式变化也具有一定的规律性。朱华平等(2013)分析了罗非鱼耐寒品系与正常组基因组DNA甲基化的差别，也发现连续多代的低温胁迫使尼罗罗非鱼DNA发生了去甲基化反应，基因组甲基化程度降低。低温处理后，水稻(华扬等, 2005)、玉米(Steward et al, 2002)等基因组甲基化也都发生了变化。这说明，外界环境变化影响了某些基因的甲基化状态，从而基因的表达状态发生改变以更加适应逆境。Gavery等(2010)已经证实，太平洋牡蛎不同基因家族的DNA甲基化状态是不同的，甲基化能够有效调控太平洋牡蛎的基因表达，尤其是抗逆和环境响应相关的基因。因此，通过对不同性状群体基因组甲基化状态进行比较分析，筛查特异性片段进而与性状关联分析，是获得目的性状相关候选基因的有效途径之一，在一些种类中已有相关报道(Hu et al, 2013; Xiao et al, 2013)。与太平洋牡蛎(姜群等, 2014)的研究结果相似，本研究也没有发现在所有个体中都稳定出现的差异片段，差异片段仅存在于部分的个体当中，这可能是由于贝类较高杂合度及所用引物少、个体对逆境反应程度不同等原因造成的。总之，通过研究急性温度胁迫对虾夷扇贝基因组DNA甲基化水平的影响，对于阐明DNA甲基化在虾夷扇贝抗逆反应中的作用，筛选重要的相关基因提供了新思路和理论参考。